miRNA和lncRNA調控動物毛囊發(fā)育的研究進展

王俊永，王天賜，王 丹，張 禹，王 昕

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

毛囊是皮膚的衍生物，因動物種類以及生長部位不同而導致其長度和形狀有所差異，但其都有相似的基本結構。毛囊由連接組織鞘、內根鞘、外根鞘、毛球和毛干等構成，大部分哺乳動物的毛囊分為初級毛囊和次級毛囊。毛球內包圍著一些密集的真皮纖維細胞，內陷形成毛乳頭，是一個發(fā)送和接收信號誘導的結構[1]。圍繞毛乳頭的部分為毛母質，毛母質的角質細胞是體內生長最快的細胞，生長期毛母質細胞增殖分化產(chǎn)生毛干和內根鞘[2]。Dicer酶是miRNA形成過程中的一個關鍵酶，特異性敲除Dicer基因導致小鼠表皮中多種miRNA減少以及小鼠的毛發(fā)生長有缺陷[3]。另一項研究表明，miRNA的加工酶Drosha酶在小鼠的毛發(fā)生長以及表皮的內穩(wěn)態(tài)方面有著重要的作用[4]。此外，在絨山羊次級毛囊發(fā)育中，lncRNA作用于Wnt信號通路從而影響毛囊生長發(fā)育[5]。越來越多的報道將miRNA、lncRNA與毛囊的生長發(fā)育緊密聯(lián)系起來，而且毛囊的發(fā)育直接影響經(jīng)濟動物毛發(fā)的品質。因此，研究miRNA和lncRNA對毛囊發(fā)育的分子調節(jié)機理及提高絨毛的產(chǎn)量和品質具有重要意義。

1 miRNA與lncRNA簡介

miRNA是一種僅有18～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于各類生物體內。miRNA的形成由基因組轉錄、pri-miRNA到成熟的miRNA序列經(jīng)歷了一系列復雜的變化。miRNA的經(jīng)典作用機制是成熟的miRNA與RNA誘導的基因沉默復合體形成miRISC，此復合物通過miRNA特異地識別特定基因的3'非翻譯區(qū)，并與之完全互補或部分互補從而抑制或者沉默mRNA的表達。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)miRNA在轉錄后水平還可以作用于5'非翻譯區(qū)、啟動子區(qū)，甚至可能抑制復制和轉錄水平[6]。從第1個miRNA（lin-4）發(fā)現(xiàn)至今，隨著高通量測序技術的高速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的miRNA在生物體內扮演著不可替代的作用，并且預測miRNA參與了動物全基因組中20%～30%基因的表達調控[7]。

LncRNA是長度大于200 nt的非編碼RNA轉錄本，不同于miRNA較為單一的作用機制，lncRNA的作用機制多樣，這與其復雜的二級和三級結構密切相關[8]；而且又根據(jù)其不同的亞細胞定位分為核lncRNA和質lncRNA，前者主要通過染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾等方式行使生物學功能，后者主要充當“誘餌分子”與蛋白質、DNA和RNA相互作用[9]。

2 miRNA在毛囊發(fā)育中的作用

2.1 miRNA在毛囊發(fā)育中的時空表達 毛囊的發(fā)育分為生長期、退行期和休止期3個階段。毛囊的形成以及周期性發(fā)育是一個分子調控過程，研究miRNA在毛囊發(fā)育不同時期的表達有著重要意義。Wang等[10]在絨山羊羊絨生長期和休止期共檢測到541個miRNA，其中有15個在生長期表達上調，8個下調；Liu等[11]對絨山羊胎兒發(fā)育過程中皮膚毛囊發(fā)育的3個重要時期（妊娠45、55、65 d）的樣本進行了高通量測序，發(fā)現(xiàn)oar-miR-377-3p、oar-let-7和oar-miR-200家族中的oarlet-7b/d/f和oar-miR-200b/c在55日齡和65日齡胎兒的表達量比45日齡胎兒上調，而oar-miR-106a和oarmiR-218a則明顯下調；Zhang等[12]鑒定了鴨子皮膚中的 miRNA，其中 miR-107、miR-10a、miR-17-3p、miR-31、miR-451、miR-2188以及miR-1623可能調控Wnt/β-catenin、Shh/BMP和Notch信號通路中的相關基因；赫曉燕等[13]制備了羊駝皮膚的miRNA芯片與Affymetrix多物種miRNA芯片跨物種雜交，并對耳部和背部皮膚的miRNA 進行篩選，結果顯示在其耳部和背部皮膚中高表達差異2倍以上的miRNA有39個，對let-7b和miR-24在2個部位的q-PCR檢測結果與基因芯片結果一致，并預測它們的靶基因與毛囊生長發(fā)育和毛發(fā)品質相關；Gao等[14]檢測到包括miR-143、miR-10a和let-7在內的14個調控湖羊毛囊發(fā)育的miRNA，其中 miR-10a、let-7i、NW_004080184.1_6326、NW_004080165.1_8572、NW_004080181.1_3961和NW_004080190.1_13733在湖羊的大波紋皮和小波紋皮中差異表達；Liu等[15]在藏綿羊毛囊中檢測到244個高表達的miRNA，其中有204個miRNA在哺乳動物中高度保守，進一步的分析確定了6個特異表達的miRNA可能作用于Wnt信號通路中的關鍵基因；Bai等[16]檢測了6個miRNA表達量在遼寧絨山羊毛囊生長期相對高于退行期和休止期，而另外7個miRNA則在退行期和休止期表達上調；Wen等[17]篩選了159個在成年山羊和綿羊皮膚及耳緣組織中表達的miRNA，其中105個高度保守，而且let-7、miR-17、miR-30、miR-15和miR-8家族的表達頻率很高。通過以上研究可見，miRNA在不同動物的皮膚中都有分布并表達，而且在毛囊發(fā)育的不同階段，miRNA的表達水平也存在差異，這說明在毛囊發(fā)育過程中相關的miRNA參與了調控。同時，miRNA表達的時空特異性也更加彰顯了其在毛囊生長發(fā)育中的重要地位。

2.2 miRNA調控毛囊生長發(fā)育的研究進展 毛囊周期性發(fā)育是多基因參與、緊密聯(lián)系且相互制約的復雜生理生化過程，miRNA可以通過靶向不同的信號通路和轉錄因子，從而對毛囊不同發(fā)育階段的調控發(fā)揮作用[18]。

2.2.1 miRNA對毛乳頭細胞的影響 毛乳頭細胞是位于毛囊基底層的信號樞紐，在毛干的形成、維持毛囊的形態(tài)發(fā)生、調控毛囊周期以及毛囊的再生方面起著重要的作用。隨著毛乳頭細胞培養(yǎng)代數(shù)的增加，逐漸失去多層聚集能力；代數(shù)低的毛乳頭細胞能夠誘導裸鼠背部長出毛發(fā)，而代數(shù)高的毛乳頭細胞不能；以miRBase 18.0為依據(jù)，通過miRNA芯片檢測到1 924個miRNA，低代數(shù)的毛乳頭細胞相對于高代數(shù)毛乳頭細胞顯著上調的有27個miRNA，下調的有106個。通過建立miRNA 和Wnt通路的網(wǎng)絡圖發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p在mRNA水平上抑制LRP6的表達，從而調控毛乳頭細胞Wnt/β-catenin通路的活化[19]。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b在絨山羊皮膚毛發(fā)周期的3個階段表達量不同，基于毛乳頭細胞構建的miR-125b的過表達模型和抑制表達模型證實了miR-125b 影 響 FGF5、IGF-1、SHH、TNF-α、MSX2、LEF-1、FGF7、NOGGIN、BMP2、BMP4、TGF-β1 和β-catenin的表達，雙熒光素酶實驗驗證了miR-125b與FGF5和TNF-α之間有著直接的作用。FGF5本身是一種生長因子，主要調控毛發(fā)的長度[21]；而TNF-α可能影響毛發(fā)的生長速度[22]。綜上表明，miRNA通過抑制與毛囊再生相關的基因及相關信號通路的關鍵分子而調控毛囊周期以及毛囊的再生能力。

2.2.2 miRNA對表皮角化細胞的影響 皮膚表皮由角化細胞和非角化細胞構成，其中毛是表皮角化的產(chǎn)物，主要由角化細胞緊緊排列而成。因此，研究miRNA對角化細胞增殖分化的影響對毛囊發(fā)育有著重要的作用。胰島素樣生長因子家族中的IGF-1R廣泛分布于毛囊中，通過與IGF結合，可以將信號傳導刺激毛囊細胞的增殖，而缺失IGF-1R基因的小鼠表皮變薄，角質細胞顯著減少[23]。miR-let7a在絨山羊生長期中的表達較退行期弱，而其靶基因IGF-1R在絨山羊生長期中的表達較退行期高[24]，表明miR-let7a對IGF-1R具有調節(jié)作用。Yuan等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-22表達量在小鼠毛囊退行期上升而在休止期達到最高；體內研究表明，過表達miR-22促進了毛發(fā)周期由生長期向退行期的過渡，對應的miR-22缺失體則延遲了進入休止期的時間，并且加速了毛囊由休止期向生長期的轉變，而過表達的miR-22通過抑制角化細胞的生長和分化同時加速細胞凋亡過程；并證實了miR-22直接抑制了多個與毛囊生長分化相關的基因，包括Dlx3、Foxn1和Hoxc13等。miR-31突變體小鼠的表皮角質細胞功能損傷，導致毛囊細胞異常的增殖、凋亡和變異；相反，在miR-31的缺失體中毛發(fā)生長得到了促進，而miR-31靶向作用于LATS2，LATS2則可以調控角質細胞的生長[26]。Ahmed等[27]研究表明，miR-214在小鼠皮膚的表皮表現(xiàn)出不同的表達模式，通過在角質細胞中的過表達來抑制其增殖，導致小鼠毛囊發(fā)育受阻、毛球數(shù)量減少以及毛發(fā)變細等現(xiàn)象。β-catenin蛋白作為Wnt信號通路中的一個關鍵信號開關，廣泛地參與到動物毛囊的發(fā)育中[28]。而miR-214對毛囊發(fā)育的抑制作用主要是通過靶向調控β-catenin從而影響Wnt信號通路來實現(xiàn)的。

2.2.3 miRNA對毛囊干細胞的影響 毛發(fā)的形成以及之后的再生需要一個持續(xù)的干細胞群來維持這一過程，而毛囊干細胞的表達有4個關鍵的調控因子，即Sox9、Tcf-3、LHx2和NFATc1[29]。已有的研究表明，TCF-3是miR-24的靶基因。 miR-24過表達使毛發(fā)變細以及改變毛發(fā)的結構，而且改變了毛發(fā)角質形成細胞的正常分化過程[30]。過表達miR-22也會損害毛囊干細胞群的形成能力[25]。Wang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，miR-205的缺失會造成新生小鼠致死以及表皮、毛囊生長嚴重受損的現(xiàn)象；在毛囊發(fā)育中，加速新生小鼠皮膚干細胞轉化沉默。因此，miRNA對毛囊干細胞的干性維持及正常的毛囊周期發(fā)育具有重要作用。

2.3 miRNA與信號通路 Wnt信號通路是眾多參與毛囊周期發(fā)育信號的重要通路之一，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路參與了皮膚的生物學過程，具有調控上皮的形態(tài)發(fā)生、毛囊發(fā)育以及相關細胞分化的作用[32]。miR-31在小鼠的生長期上調并且在退行期和休止期下調，而miR-31缺失導致毛囊生長期加速發(fā)育并且改變了毛基質細胞的分化和毛干的形成。研究表明，miR-31負調節(jié)FGF10，而FGF10是Wnt通路和BMP通路的一個信號分子[33]。李珊珊等[34]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1623在麒麟雞皮膚中高度表達， Wnt信號通路中Wnt4基因的3'UTR存在miR-1623的結合位點（TGCCTG）；q-PCR以及雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)，相對于懷鄉(xiāng)雞，麒麟雞皮膚中的miR-1623表達水平顯著升高，而Wnt4 mRNA的表達水平顯著降低，因此miR-1623靶向負調控Wnt4。唐曉慧等[35]的研究結果表明，miR-184在皮膚中表達最強，并且在毛囊生長期到退行期的表達量有上升趨勢；miR-205在多個組織中均有表達，且皮膚、肺、腎臟、小腸、直腸、瘤胃、肌肉中的表達量較高，而miR-205則表現(xiàn)出先升后降，在退行期的表達量最高，兩者的候選靶基因則可能通過Wnt信號通路調控毛囊的生長周期。

TGF-β信號通路具有調控細胞的生長、分化、凋亡、遷移及細胞外基質的形成等多種重要的功能，而miR-1298-5p則通過抑制TGF-βR1間接的調控TGF-β信號通路，進而影響毛囊的正常發(fā)育[36]。在新生小鼠皮膚中，miR-205則通過負調節(jié)pi3k信號通路來保證皮膚干細胞的正常增殖[32]。由此可見，miRNA主要通過調控相關信號通路的信號分子從而影響毛囊的周期發(fā)育。

2.4 miRNA影響動物毛色的相關進展 毛色也是毛用動物重要的經(jīng)濟性狀之一，哺乳動物的毛色主要由被毛發(fā)育和黑色素種類及數(shù)量共同決定。朱芷葳等[37]檢測出20個在成年羊駝皮膚組織中高表達的miRNA，其中miR-25對色素形成關鍵基因Mitf具有調控作用，表明miR-25可能參與到羊駝毛發(fā)顏色的調控過程。

賈小云等[38]檢測了miR-663在羊駝皮膚中的表達量，并從mRNA和蛋白水平上證明miR-663能夠靶向抑制TGF-β1的表達而影響TGF-β/Smad 和 Wnt信號通路，進而影響羊駝黑色素細胞中的黑色素合成。Wu等[39]通過對不同顏色山羊（白色和黑色）毛囊樣本的測序，檢測到6個異常表達的miRNA，其中miR-10b通過影響DVL3來調控Notch信號通路，且miR-211的表達模式與miR-10b相類似，而包括Notch和MAPK等的多個信號通路都可能調節(jié)羊毛顏色的形成，這表明miRNA在調控羊毛顏色形成上有著重要的作用。Qu等[40]研究表明，miR-202在黑色小鼠皮膚中的表達高于白色小鼠中，而且wnt5a、kit和tcf7在黑色小鼠體內的表達與miR-202負相關，說明miR-202在白色小鼠和黑色小鼠中有著不同的表達方式，即可能調控小鼠毛色的形成。

3 LncRNA在毛囊發(fā)育中的作用

LncRNA的作用機制多種多樣，但目前發(fā)現(xiàn)的影響毛囊發(fā)育的大部分lncRNA仍集中在通過調控相關的信號通路以及調控相關基因的甲基化等來實現(xiàn)。

3.1 毛囊生長發(fā)育相關的lncRNA的鑒定 Wang等[10]通過高通量測序鑒定了絨山羊毛囊發(fā)育的生長期和休止期的1 108個lncRNA，與休止期相比，其中有41個lncRNA表達量在生長期上調，157個lncRNA表達量下調；同時檢測了lncRNA對其靶基因cis和trans的影響，推測這些lncRNA在毛囊發(fā)育和毛囊周期調控中具有一定的功能。郭楊等[41]對羊絨生長期和休止期顯著差異表達lncRNA進行了篩選及qRT-PCR驗證，并對其中的5個lncRNA（lncRNA9686、lncRNA14672、lncRNA19457、lncRNA15479和lncRNA13025）構建了過表達載體，為進一步研究lncRNA的功能和探討特異性lncRNA在羊絨生長中的作用機制奠定了基礎。Yue等[42]研究分析了大量lncRNA以及編碼RNA在毛囊形成過程中的作用，其中只有Wnt2、FGF20在Wnt、Shh、Notch和BMP信號通路中差異顯著，而lncRNA表達譜的分析共檢測到15個顯著差異表達的lncRNA，其中6個上調，9個下調。這些關鍵的差異表達基因和lncRNA可能調節(jié)毛囊發(fā)育的起始分子機制。毛囊的起始階段是毛囊形成的第一個也是最重要的階段。Zhu等[43]分離了來自遼寧絨山羊次級毛囊的lncRNA-H19轉錄物，其中生長期lncRNA-H19轉錄本的相對表達量顯著高于休止期和退行期，表明lncRNA-H19轉錄本可能在山羊絨纖維的形成和生長中起重要作用。甲基化分析表明，H19基因啟動子區(qū)的甲基化可能參與了遼寧絨山羊次級毛囊的轉錄抑制。

3.2 LncRNA調控毛囊生長發(fā)育的研究進展 劉陽[19]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與Wnt通路中的mRNA存在3種關系：一是兩者呈正相關（約占79%），二是兩者呈負相關，三是mRNA不隨lncRNA的上調或下調而出現(xiàn)差異表達現(xiàn)象。而在上調的基因中，H19有5個轉錄 本（ENST00000442037、uc001lva.4、uc021qbz.1、ENST00000439725和 ENST00000417089）， 它 們 是位于11號染色體上的lncRNA，microarray 顯示上調倍數(shù)在56～12倍，而相關研究顯示 H19能夠促進Wnt/β-catenin 信號通路的激活[44]；差異表達的WIF1的mRNA下調了25.036 993倍，而WIF1是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵抑制因子，因而猜測毛乳頭細胞中的lncRNA通過促進WIF1的甲基化來激活Wnt/β-catenin通路。Lin等[45]通過lncRNA微陣列發(fā)現(xiàn)，相較于第10代毛乳頭細胞，第4代毛乳頭細胞中有1 683個lncRNA上調以及1 773個下調，其中RP11-766N7.3、H19和HOTAIR這3個lncRNA在毛乳頭細胞以及Wnt信號通路中表達量異常，這可能為早期分化毛乳頭細胞的毛囊誘導分化機制提供了新的研究方向。劉善博等[46]對細毛羊毛囊形態(tài)發(fā)生前期及基板期皮膚組織進行 RNA-seq， 通 過 CNCI、PhyloCSF、Pfam 對 測 序數(shù)據(jù)進行預測，共獲得 884 個新的 lncRNA，其中13個lncRNA 存在潛在 cis 或 trans 靶基因，通過 GO、KEGG 富集分析，將 13 個差異 lncRNA 的靶基因顯著富集到 NOD 樣受體信號通路、利什曼病信號通路和NF-kappa B 信號通路中，說明這些差異表達的 lncRNA可能通過信號通路參與細毛羊毛囊形態(tài)發(fā)生過程。此外，基于熒光素酶報告基因系統(tǒng)的靶向關系表明，oarmiRNA-3955-5p 與 lncRNA005698 之間具有靶向關系，說明lncRNA005698 可能在細毛羊毛囊形態(tài)發(fā)生過程中起著重要作用，并且可能通過調節(jié) oar-miRNA-3955-5p來調節(jié)細毛羊毛囊形態(tài)發(fā)生。lncRNA的作用方式多樣，既可以通過Cis或Trans方式作用于靶基因，也可以作為內源性競爭RNA（ceRNA）競爭性的結合在靶基因上。由于lncRNA在調控毛囊發(fā)育的研究上目前仍處于起步階段，因此對于lncRNA在毛囊發(fā)育中的重要作用及具體的機制仍需要深入研究。

4 存在問題及展望

miRNA主要通過作用于特定基因的3′非翻譯區(qū)從而抑制或沉默基因的表達，其在毛囊的生長發(fā)育中的重要作用已經(jīng)有很多報道，但目前關于miRNA參與毛囊發(fā)育的研究主要集中在miRNA的篩選及靶基因的鑒定方面，在動物體內的功能研究，尤其是家畜上的研究更為有限。因此，未來應該在體內和體外水平上對miRNA的調控機制進行深入研究，為家畜育種工作提供理論基礎。

lncRNA雖然不具有編碼能力，但其與細胞周期和分化、發(fā)育及多種人類疾病密切相關，能夠在轉錄水平、轉錄后和表觀遺傳調控等多個層面上調控基因的表達水平。在毛囊發(fā)育領域，lncRNA的研究主要集中在篩選和鑒定影響毛囊發(fā)育的lncRNA，而對其調控機制尚不清晰，因此lncRNA的研究對揭示動物毛發(fā)生長的分子調控機制具有重要的意義。