基于近紅外熒光制劑的多模態(tài)多功能分子影像技術(shù)在腫瘤模型中的應(yīng)用

師長宏

(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心， 西安 710032)

小動物分子影像技術(shù)能夠在活體狀態(tài)下對動物模型進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能成像，從而反映全身、局部器官與組織甚至分子水平的變化；甚至能夠進(jìn)行定量研究，精準(zhǔn)描述疾病模型的生理變化過程。目前常用的小動物分子影像技術(shù)主要包括光學(xué)成像、核素分子影像(PET，SPECT)、CT和MRI。單一模態(tài)的分子影像技術(shù)由于低分辨率和空間位置信息解讀困難等缺點(diǎn)不能滿足科學(xué)研究的需要，而整合多種分子影像技術(shù)優(yōu)勢的多模態(tài)融合分子影像不僅可以提供功能圖像，而且能夠呈現(xiàn)解剖結(jié)構(gòu)，提高了傳統(tǒng)影像定位、定性的準(zhǔn)確性，目前已成為分子影像研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢[1]。

近紅外熒光(near-infrared fluorescence，NIRF)試劑具有高消光系數(shù)、較大的斯托克斯變化，可在700～1000 nm內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)熒光發(fā)射能力[2]；同時，生物組織在NIR光譜中自發(fā)熒光低，確保了NIRF的組織穿透力，從而為NIRF活體成像技術(shù)應(yīng)用體內(nèi)腫瘤診斷提供了可能[3]。本綜述總結(jié)了基于NIRF染料的多模態(tài)多功能分子影像技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 腫瘤靶向性NIRF染料在腫瘤模型中的應(yīng)用

NIRF成像由于其多重檢測能力和高靈敏度可用于癌癥的早期診斷。吲哚菁綠(indocyanine green, ICG) 是目前唯一被美國FDA(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的NIRF成像試劑，但其不具有腫瘤靶向性，在腫瘤細(xì)胞中的積累主要取決于增強(qiáng)的通透性和保留(enhanced permeability and retention effect，EPR)效應(yīng)，而不是主動的靶向特征，這易導(dǎo)致正常細(xì)胞的非特異性集聚[4]。新近報道的七甲川菁(heptamethine cyanine)染料是一類具有腫瘤靶向性NIRF化合物，包括IR780、IR808、IR820、IR783和MHI-148等，該類染料能夠被特異性識別并集聚于腫瘤細(xì)胞[5]。如將腎癌病人的腎臟切除后灌注MHI-148或IR-783染料，發(fā)現(xiàn)腎癌病灶中有近紅外熒光信號集聚，并能檢測到腎癌病人的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)[6]。MHI-148在胃癌和肝癌的PDX小鼠模型中顯示特異性積累，灌注臨床胃癌標(biāo)本在腫瘤部位可檢測到特異性熒光[7-8]。與其他NIRF染料相比，七甲川菁染料在腫瘤細(xì)胞中積累能力強(qiáng)，具有高的穩(wěn)定性和良好的信噪比。這主要有三方面原因：①腫瘤細(xì)胞具有高的線粒體膜電位；②腫瘤細(xì)胞中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion-transporting polypeptides, OATP)高表達(dá)，特別是OATP1B3介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞對七甲川菁染料的特異性吸收；③已證實(shí)腫瘤細(xì)胞對MHI-148的吸收是通過OATPs和缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF1α)的聯(lián)合作用[2]。

同時，該類染料在808 nm以上激光照射下能夠殺滅腫瘤細(xì)胞，這提供了光熱治療(photothermal therapy, PTT)和光動力治療(photodynamic therapy, PDT)的可能[8]。進(jìn)一步利用其對腫瘤細(xì)胞的靶向性，將該染料結(jié)合抗癌藥物或進(jìn)行納米顆粒修飾用于腫瘤的組合治療，從而使七甲川菁染料成為熒光成像、靶向治療以及腫瘤藥物遞送載體的有效候選試劑[9]。

2 納米修飾的NIRF 染料用于光學(xué)成像

常規(guī)NIRF 染料用于體內(nèi)成像主要存在三方面問題：①水溶性差；②缺乏腫瘤靶向性；③光漂白嚴(yán)重，不能長時間進(jìn)行影像檢測。納米材料包裹后可改善NIRF染料的水溶性，連接腫瘤特異性受體可增強(qiáng)其靶向性，同時減弱其光漂白效應(yīng)。七甲川菁染料自身具有的腫瘤靶向性、高量子產(chǎn)率和生物組織中低的自發(fā)熒光使其成為優(yōu)異的腫瘤影像探針[10]；同時，由于該類染料具有的多重功能和結(jié)構(gòu)特征，納米材料修飾后可使其對腫瘤的治療效果提高數(shù)倍，顯著優(yōu)于ICG。使用碳二亞胺將IR783與明膠結(jié)合，然后加入氧化鐵，最后用人血清白蛋白包裹制備成納米顆粒，可用于檢測結(jié)腸癌的發(fā)生[11]?；贗R780的納米顆粒是將IR780加載到脂質(zhì)體中，制備成大小分別為95 nm和26 nm的IR780磷脂膠束。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的線粒體對上述納米顆粒和游離染料都具有良好的攝取效果。與IR780-脂質(zhì)體相比，體內(nèi)成像顯示IR780磷脂膠束在U87腦膠質(zhì)瘤原位移植模型中的積累增加，這表明IR780磷脂膠束對腦腫瘤具有強(qiáng)的靶向性[12]。當(dāng)IR784被聚乙二醇化形成100～220 nm的納米顆粒GUMBOS時，該材料通過紫外光譜測量顯示出122 nm的斯托克斯偏移，具有更好的光穿透效能，從而在體內(nèi)成像中顯示出良好的優(yōu)勢[13]。除電荷和形狀外，由于EPR效應(yīng)，納米材料的大小與腫瘤的富集密切相關(guān)，有研究顯示68 nm的ICG脂質(zhì)聚合物納米顆粒對腫瘤細(xì)胞的集聚能力顯著高于118 nm的顆粒，滯留能力也優(yōu)于38 nm的材料。

3 NIRF 染料的多模態(tài)多功能成像

雖然NIRF染料在腫瘤診斷中顯示出良好的優(yōu)勢，但其用于生物成像的缺點(diǎn)在于低的空間分辨率。由于MRI和PET可提供更高的分辨率，NIRF技術(shù)結(jié)合MRI或PET成像可以彌補(bǔ)單一成像方式的不足。

3.1 NIRF /MRI雙模成像

NIRF成像靈敏度高，信噪比低，但空間分辨率差，而 MRI可提供高分辨率的解剖信息，與和NIRF技術(shù)組合后，可提供精確的空間圖像，不僅能夠完成高分辨率的解剖成像，而且可用于以低靈敏度對低分子靶點(diǎn)進(jìn)行成像。利用NIRF染料在腫瘤模型非侵入性成像中的優(yōu)勢，將IR825染料與Mn2+和聚多巴胺(polydopamine, PDA)組成的納米金屬有機(jī)顆粒(nanoscale metal-organic particles, NMOP)，再形成具有外部聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)層的核-殼納米顆粒，即Mn-IR825@PDA-PEG NMOP。該顆粒通過Mn2+介導(dǎo)，光學(xué)成像和IR825的光熱特性提供T1加權(quán)的MRI圖像，同時具有良好的腫瘤靶向性，能夠被腎臟快速代謝，因此該納米顆粒可用于多模態(tài)成像[14]。NIRF染料也可與釓(gadolinium, Gd)偶聯(lián)用于雙模成像，例如，MHI-148與不同類型的多孔Gd硅酸鹽結(jié)合形成納米顆粒(多孔Gd硅酸鹽@ mSiO2)可改善T1-T2效應(yīng)，同時結(jié)合MHI-148腫瘤靶向性，提供了納米顆粒的多模態(tài)功能[15]。IR825與人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)結(jié)合，并與DTPA-Gd共價連接， 形成的HSA-Gd-IR825納米復(fù)合物能夠通過淋巴循環(huán)，可靶向檢出前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node, SLN)。同時，借助于MRI和NIRF成像技術(shù)，推動了“光熱消融輔助手術(shù)”策略[16]。IR825與陽離子聚合物聚烯丙胺鹽酸鹽(polyallyl amine hydrochloride, PAH)形成納米復(fù)合物可用于體內(nèi)NIRF成像。進(jìn)一步將該系統(tǒng)與氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticles, IONP)結(jié)合，再與聚乙二醇化形成IR825@PAH-IONP-PEG復(fù)合納米顆粒，該化合物具有NIRF成像特征和T2對比度，當(dāng)用915 nm激光照射時具有光熱效能。4T1腫瘤模型注射該顆粒后，MRI分析顯示腫瘤部位具有高的顆粒物聚集，其介導(dǎo)的腫瘤靶向特征，最終可在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)光熱消融治療腫瘤[17]。

通過成像技術(shù)提供準(zhǔn)確的術(shù)前檢測和術(shù)中導(dǎo)航對肝癌手術(shù)的成功至關(guān)重要。MRI/NIRF雙模成像已被成功應(yīng)用于肝癌的術(shù)中導(dǎo)航(intraoperative navigation)。MRI由于其良好的軟組織對比度和空間分辨率，常用于肝癌臨床診斷[18]。由于其獨(dú)特的靈敏度和實(shí)時性，術(shù)中的NIRF導(dǎo)航也常應(yīng)用于指導(dǎo)腫瘤的切除[19]。但單一成像模式不能同時提供臨床所需的肝癌術(shù)前結(jié)構(gòu)特征和術(shù)中局部功能信息，而MRI/NIRF雙模分子影像可結(jié)合兩種成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，為肝癌患者提供更好的治療效果。一種新型雙模態(tài)磁MRI/NIRF探針由涂覆有脂質(zhì)體的超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide, SPIO)納米顆粒組成，腫瘤靶向藥物Arg-Gly-Asp肽(RGD)和NIRF染料(ICG)均結(jié)合到該探針上[20-21]，并成功用于肝原位腫瘤和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型的術(shù)前診斷和術(shù)中導(dǎo)航。注射該探針后MRI和熒光圖像顯示出清晰的腫瘤邊界(SPIO@Liposome-ICG-RGD)，MRI檢查獲得信噪比為(31.9±25.4)，可檢測到微小腫瘤(0.9±0.5) mm。注射探針72 h后，NIRF成像顯示腫瘤與背景的最大比值為(2.5±0.3)，在術(shù)中導(dǎo)航可有效獲取微小腫瘤病變 (0.6±0.3) mm[22]。該新型MRI/NIR雙模探針有望實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的肝腫瘤檢測和切除。也有人將多模態(tài)成像劑與Gd(III)螯合物結(jié)合，并與PEG接頭或短烷基接頭，再與IR-783染料耦合。該化合物具有強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記能力，使用MRI和NIRF成像均可在腫瘤模型中檢測到腫瘤的發(fā)生。通過熒光成像可在MCF7腫瘤移植模型中檢測該化合物的積累，并通過MRI成像檢測腎臟清除效果[23]。

3.2 NIRF/PET雙模成像

核素成像(PET/SPECT)廣泛應(yīng)用于腫瘤檢測，常規(guī)核素探針缺乏靶向性，半衰期短，獲得的圖像空間分辨率低，除了暴露于輻射外，還易導(dǎo)致高基礎(chǔ)代謝率的組織如腦的核素富集[24]。由于NIRF染料能夠直接靶向癌細(xì)胞，同位素標(biāo)記的NIRF染料可通過其靶向性實(shí)現(xiàn)對腫瘤的非侵入性成像，這兩種技術(shù)的結(jié)合可能成為腫瘤分子成像的“金標(biāo)準(zhǔn)”[25]。

NIRF染料標(biāo)記核素后在腫瘤異種移植模型中成像的敏感性和靶向性顯著提高，有望實(shí)現(xiàn)NIRF染料用于檢測深部組織腫瘤的功能。一種NIRF/PET探針PC-1001-64Cu，是將NIRF靶向染料PC-1001與64Cu共軛結(jié)合用于乳腺癌PET和熒光成像，這種化合物已在乳腺癌異種移植模型中得到驗(yàn)證[26]。與心臟、肝臟、肺和脾相比，腫瘤組織的攝取和積累量最高，隨著時間的推移，吸收速率進(jìn)一步降低。在RANKL過表達(dá)的LNCaP轉(zhuǎn)移性前列腺癌(prostate cancer, PCa)異種移植模型中，注射NIRF染料PC-1001后，NIRF成像在小鼠模型中只能檢測到兩個淺表腫瘤，而64Cu-PC-1001化合物注射同一荷瘤鼠后通過PET成像則在小鼠的深部組織顯示出第三個腫瘤，表明NIRF/PET檢測的靈敏度增強(qiáng)[27]。腫瘤靶向SPECT/NIRF雙模探針PC-1007/99mTc在腫瘤移植模型中顯示出特異性腫瘤靶向和積累特性[28]。

犬腫瘤細(xì)胞和人PCa細(xì)胞對MHI-148的吸收具有相似的機(jī)制。同位素68Ga標(biāo)記MHI-148后注射自發(fā)腫瘤犬，并通過PET掃描證實(shí)了腫瘤部位對MHI-148特異性攝取和富集。將MHI-148-DOTA復(fù)合物(PC-1001)結(jié)合64Cu用于乳腺癌多模態(tài)靶向成像，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明該復(fù)合物在腫瘤部位顯著積累，24 h時增加4.3倍，48 h增加5.8倍[29]。

3.3 NIRF 染料介導(dǎo)的抗腫瘤藥物靶向傳遞系統(tǒng)

盡管使用肽、蛋白質(zhì)和聚合物已經(jīng)開發(fā)了各種大分子藥物遞送系統(tǒng)并用于不同類型腫瘤的臨床前模型，但七甲川菁染料作為腫瘤特異性藥物遞送載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：①易于化學(xué)修飾以達(dá)到最佳的藥理效果；②跨細(xì)胞膜的高滲透性；③化學(xué)穩(wěn)定性和低成本。七甲川菁染料標(biāo)記化療藥物后通過其靶向性，引導(dǎo)藥物在腫瘤細(xì)胞特異性集聚，從而實(shí)現(xiàn)靶向傳遞，不僅可以實(shí)時監(jiān)測治療效果，并且能夠降低藥物劑量，避免潛在的副作用[2]。Shi 等[30]將IR780碘化物與抗腫瘤藥物氮芥共軛結(jié)合形成IR780NM，熒光成像顯示IR780在腫瘤細(xì)胞線粒體中積聚?；铙w成像顯示IR780NM保留其腫瘤靶向特性，說明該化合物可能成為有效的腫瘤靶向成像和藥物傳遞系統(tǒng)。Wu等[31]通過將MHI-148染料與clorgyline衍生物(新型前列腺癌治療藥物—單胺氧化酶A的小分子抑制劑)結(jié)合形成了NMI化合物。NMI在PCa異種移植模型中顯示腫瘤靶向特性，并顯著抑制PCa生長。說明這種NMI化合物不僅具有診斷潛能，并可能成為下一代抗癌治劑。另外，IR-783-多西紫杉醇綴合物在Pca脛骨轉(zhuǎn)移模型中顯示良好的腫瘤治療效果，而且在治療期間沒有發(fā)現(xiàn)荷瘤鼠的全身毒性反應(yīng)和體重減輕。上述結(jié)果表明NIRF染料可能成為化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的有效載體[27]。

腦瘤化療的主要挑戰(zhàn)是如何從全身循環(huán)中將藥物有效遞送到腫瘤部位，并減少非特異性生物分布的副作用，其主要原因是血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)和血液腫瘤屏障(blood-tumor barrier, BTB)的存在使藥物較難到達(dá)腫瘤部位[32]。將IR-783染料與化療藥物gemcitabine結(jié)合形成染料-藥物偶聯(lián)物(near-infrared gemcitabine, NIRG)注射膠質(zhì)瘤原位移植模型，發(fā)現(xiàn)NIRF染料能夠有效通過BBB/BTB將化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤部位，抑制膠質(zhì)瘤和前列腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤的生長，延長荷瘤鼠的生存時間。這些結(jié)果表明NIRF染料-藥物共軛物可能成為腦膠質(zhì)瘤的有效治劑[33]。

3.4 NIRF/PAI雙模成像

普通光學(xué)成像由于光子的物理特性，只能穿透深度約1 mm的軟組織之后就會散射出去，而光聲成像(photoacoustic imaging, PAI)將光學(xué)和超聲這兩種成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有效結(jié)合，將組織深處的吸收光轉(zhuǎn)變成聲波，并依據(jù)光聲信號來重建組織內(nèi)光能量吸收分布的圖像，從原理上避開光學(xué)散射的影響[34]。NIRF 染料IR780具有PAI特性，它比ICG更穩(wěn)定，通常被用作光學(xué)/光聲劑。通過體內(nèi)研究證實(shí)，由?聚ε-己內(nèi)酯共軛螺旋聚形成的異氰化苯，包裹 IR780 /喜樹堿組成多功能納米復(fù)合物具有NIRF光學(xué)/ PAI成像特征，并可發(fā)揮PTT / 化療效能[35]。

4 NIRF分子影像技術(shù)的應(yīng)用展望

理想的分子影像技術(shù)應(yīng)該能夠同時提供生物過程中解剖結(jié)構(gòu)、功能代謝、生理病理和分子細(xì)胞的信息，但沒有一種成像技術(shù)能夠同時具備上述功能。目前，基于NIRF染料的PET/MRI雙模態(tài)成像技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，甚至出現(xiàn)三模態(tài)成像。同時，人們開始進(jìn)一步優(yōu)化七甲川菁染料結(jié)構(gòu)，提高其生物相容性，生物穩(wěn)定性和熒光特性[36]。經(jīng)過分子修飾后增強(qiáng)其疏水性、腫瘤靶向性以及對腫瘤細(xì)胞的毒性[37]。除此之外，人們嘗試通過修飾染料結(jié)構(gòu)增強(qiáng)其穩(wěn)定性和光敏特性?？傊呒状ㄝ既玖系亩鄠€復(fù)合物已被用作多模態(tài)成像，成為光熱，光動力學(xué)和組合治療的新策略，未來，該類染料可能成為腫瘤成像和治療的合適選擇。

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