交叉引物擴(kuò)增-試紙條法：一種快速現(xiàn)地檢測(cè)非洲豬瘟病毒的新技術(shù)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染豬而引起的一種高度傳染性、致死性疾病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列入必須報(bào)告的動(dòng)物疫病。該病自1921年首次在肯尼亞被發(fā)現(xiàn)以來，已擴(kuò)散至全球數(shù)十個(gè)國家。2018年8月我國沈陽爆發(fā)首例非洲豬瘟疫情，截止11月8日，我國已有17個(gè)省份發(fā)生62起ASF疫情，對(duì)我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了重創(chuàng)。然而，迄今為止，尚無商品化非洲豬瘟疫苗可用，僅能依靠嚴(yán)格的撲殺措施防控該病。因此快速、可靠、靈敏的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于疫情的控制至關(guān)重要。目前，ASF診斷技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)是病毒分離，其他檢測(cè)方法包括熒光抗體試驗(yàn)(FAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和熒光定量 PCR等。但這些診斷方法有的耗時(shí)較長，有的需要特殊儀器，均難以在現(xiàn)地進(jìn)行。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、并能在現(xiàn)地進(jìn)行檢測(cè)的診斷方法，對(duì)于防控該病具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

針對(duì)這一重大需求，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬烈性傳染病團(tuán)隊(duì)建立了一種交叉引物擴(kuò)增-診斷試紙聯(lián)用方法(Cross-priming amplification combined with immunochromatographic strip，CPA-strip)，該技術(shù)可用于ASFV的現(xiàn)地快速檢測(cè)。該研究基于目前ASFV毒株基因組的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物及探針，兩個(gè)探針分別標(biāo)記生物素和FITC。CPA擴(kuò)增產(chǎn)物的兩末端同樣標(biāo)記有生物素和FITC，在試紙條檢測(cè)線處形成膠體金-抗生物素抗體-擴(kuò)增產(chǎn)物-抗FITC抗體偶聯(lián)復(fù)合物，膠體金固定在檢測(cè)線處，檢測(cè)線顯色指示陽性結(jié)果。應(yīng)用該方法對(duì)豬瘟病毒等常見豬病原進(jìn)行檢測(cè)均無交叉反應(yīng)；敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法最低檢測(cè)限為200拷貝；組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，試紙條重復(fù)性良好，檢測(cè)線處顏色無明顯差異；用該方法檢測(cè)非疫區(qū)100份組織和57份血液樣品，檢測(cè)結(jié)果全為陰性。此外，對(duì)45份非洲疫區(qū)臨床全血DNA樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法與熒光定量PCR的符合率為97.8%(44/45)。

該研究建立的CPA-strip方法，通過交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合診斷試紙檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，無需特殊儀器，可在現(xiàn)地進(jìn)行檢測(cè)，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)，符合目前現(xiàn)地對(duì)ASFV檢測(cè)的需求，具有巨大應(yīng)用前景。此外，常規(guī)的診斷試紙主要用于抗原或抗體的檢測(cè)，但在該研究中，診斷試紙檢測(cè)物為末端修飾的PCR產(chǎn)物，檢測(cè)靶標(biāo)為DNA分子，具有較強(qiáng)的新穎性和創(chuàng)造性。當(dāng)然，該方法為單通道檢測(cè)，如果需要同時(shí)對(duì)數(shù)百個(gè)或上千個(gè)樣本同時(shí)檢測(cè)，則難以實(shí)現(xiàn)。鑒于此，多通道大規(guī)模樣品的快速檢測(cè)將成為該技術(shù)的未來發(fā)展方向。

評(píng)述論文來源：Gao Yao,Meng Xing-Yu,Zhang Hua-wei,et al.Cross-priming amplification combined with immunochromatographic strip for rapid on-site detection of African swine fever virus[J].Sensor Actuat B-Chem,2018,274:304-309.DOI:https://doi.org/10.1016/j.snb.2018.07.164.