Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1 mRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達及臨床意義

王春輝 劉乃杰 谷潔冰 唐 棟 韓雪梅 王立波

(吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021)

長期氧化應激與包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種疾病的發(fā)生高度相關〔1～3〕。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷(ECH)相關蛋白(Keap)1-核因子E2相關因子(Nrf)2/抗氧化反應元件(ARE)是目前發(fā)現(xiàn)的最重要抗氧化應激通路之一，在維持機體氧化-抗氧化生理平衡和防御氧化損傷等方面發(fā)揮著極為重要的作用〔4〕。Keap1和Nrf2作為氧化應激的關鍵調(diào)節(jié)者，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達值得關注。Nrf2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中呈差異性表達，并與腫瘤分級及生存期等臨床特征相關〔5,6〕。然而，Keap1 mRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達變化未見文獻報道。本研究通過實時熒光定量PCR的方法對神經(jīng)膠質(zhì)瘤中Keap1 mRNA進行定量檢測，并分析其與臨床病理分級的相關性，以探討Keap1 mRNA的表達在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)外科神經(jīng)膠質(zhì)瘤手術患者43例，男25例，女18例，平均年齡(53.7±16.2)歲，中位年齡54歲。手術標本均經(jīng)組織病理學確診，置于凍存管中，加入RNA保存液浸泡組織，液氮速凍，-80℃冰箱保存。樣本臨床病理分級：Ⅰ～Ⅱ級25例，Ⅲ～Ⅳ級18例。31例對照標本來源于顱腦外傷減壓術患者，男18例，女13例，平均年齡(53.1±11.3)歲，中位年齡54歲。兩組年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2主要儀器及試劑 超微量紫外分光光度計(NANODROP公司，美國)，ABI7500 實時熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。TRNzol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green(天根公司，北京)。

1.3引物設計 根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫公布的人類Keap1 mRNA全長序列(登錄號：NM_012289)，采用Primer3軟件設計引物：Keap1上游:5′-CCAACCGACAACCAAGACC-3′,下游5′-CTCAGTGGAGGCGTACATCA-3′。β-actin上游：5′-CCCAGCCATGTACGTTG CTAT-3′，下游：5′-TCACCGGAGTCCATCACGAT-3′。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.4實時熒光定量PCR檢測 取出組織，稱重50 mg，勻漿機勻漿，加入1 ml TRNzol，按照操作說明提取RNA，超微量紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度。運用隨機引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將500 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。建立定量PCR反應體系：2×SYBR Green 10 μl，cDNA 2 μl，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.2 μl，加無RNA酶水至20 μl。ABI7500 實時熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件如下：95℃預變性1 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s， 40個循環(huán)后95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s進行熔解曲線分析。每個樣本3個復孔，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔCt法分析樣本中Keap1 mRNA相對含量。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

熔解曲線波形一致，波峰單一銳利，無非特異性波峰出現(xiàn)，表明引物較好，無非特異性擴增，結(jié)果可靠。神經(jīng)膠質(zhì)瘤組中Keap1 mRNA表達量(0.59±0.64)顯著低于對照組(1.09±0.93；t=2.57，P=0.01)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤Ⅲ～Ⅳ級Keap1 mRNA表達量(0.37±0.32)顯著低于Ⅰ～Ⅱ級(0.75±0.77；t=2.20，P=0.04)。Keap1 mRNA表達水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者年齡(≥44歲，n=23，0.53±0.45；<44歲，n=20，0.67±0.82)和性別(男0.56±0.59，女0.64±0.72)無明顯相關性(t=-0.68，P=0.50;t=-0.39,P=0.70)。

3 討 論

氧化應激是指在遭受各種外界有害刺激時，機體內(nèi)產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，如活性氧自由基和活性氮自由基，超出清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導致組織器官損傷〔4,7〕。Nrf2是機體抗氧化應激過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下，Nrf2位于細胞質(zhì)內(nèi)，與接頭蛋白Keap1結(jié)合形成異二聚體，使Nrf2被迅速降解。應激狀態(tài)下，Nrf2與Keap1解離后轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，通過與ARE相互作用，活化抗氧化酶和蛋白，發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。

Nrf2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達，與腫瘤分級和生存期等臨床特征相關〔5,6〕。低表達Nrf2可通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、血管形成，促進細胞凋亡和替莫唑胺誘導的細胞自噬〔8～10〕。探索靶向Nrf2藥物成為研究的新方向，例如，檜醇可通過抑制Nrf2表達減少膠質(zhì)瘤干細胞自我更新、侵襲、遷移和克隆形成等腫瘤特性，發(fā)揮抗腫瘤作用〔11〕。Fan等〔12〕報道，過表達Nrf2或低表達Keap1能夠加快膠質(zhì)瘤細胞增殖和腫瘤形成，抑制細胞程序性死亡，例如鐵死亡。激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路能夠上調(diào)胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達，促進谷氨酸分泌，從而影響腫瘤微環(huán)境。全反式視黃酸可通過下調(diào)Keap1的表達抑制膠質(zhì)瘤細胞生長，使細胞周期阻滯于G0/G1期，并增強替莫唑胺誘導的細胞自噬〔13〕。

本研究提示Keap1 mRNA的表達不僅與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病有關，而且與腫瘤惡性程度有關。關于Keap1 mRNA低表達的原因，有研究顯示膠質(zhì)瘤患者Keap1啟動子區(qū)CpG存在高度甲基化，高甲基化患者的無進展生存期更短〔14〕，表明Keap1的表觀遺傳調(diào)控可能參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病，其確切機制有待進一步研究。若探明其分子機制，將有望針對Keap1開發(fā)安全有效的藥物治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

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