高效液相色譜法同時測定炒防風(fēng)中升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷含量

焦坤

（安徽省阜陽市食品藥品檢驗檢測中心，安徽阜陽236500）

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，具有解表、祛風(fēng)、勝濕、止痙的功效，用于感冒頭痛、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢及破傷風(fēng)等[1]。炒防風(fēng)為防風(fēng)的加工炮制品，臨床應(yīng)用廣泛，常與白術(shù)、陳皮、白芍同用，健脾止瀉，用于肝旺脾虛、腸鳴腹痛、大便泄瀉，瀉必腹痛。防風(fēng)的化學(xué)成分主要有色原酮類[2]、香豆素類[3－4]、揮發(fā)油[5－8]、多糖類[9]等。研究顯示，防風(fēng)中的色原酮是其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)[10－12]。目前，關(guān)于防風(fēng)有效成分含量測定的研究較多。胡紫艷等[13]測定了不同產(chǎn)地防風(fēng)中的升麻素、升麻素苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷4種色原酮。邵留英等[14]對不同產(chǎn)地的防風(fēng)中升麻苷及5－O－甲基維斯阿米醇苷的含量進行了對比分析。趙博等[15]用高效液相色譜法（HPLC）同時測定了防風(fēng)中6個主要成分的含量。2015年版《中國藥典（一部）》規(guī)定防風(fēng)的質(zhì)量分析，以升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷為指標(biāo)性成分。而關(guān)于炒防風(fēng)含量測定方面研究較少，缺乏有效的質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究中建立了同時測定升麻素和5－O－甲基維斯阿米醇苷含量的HPLC法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Thermo UItiMate 3000型高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)，包括DAD3000型檢測器、變色龍7.2軟件工作站；梅特勒XPE205DR型電子天平(0.01 mg)；ELMA－E100H型超聲清洗儀(德國艾爾瑪儀器公司)。

試藥：升麻素苷（Prim－O－glucosylcimifugin）對照品（批號為111522－201310，含量為95.0%），5－O－甲基維斯阿米醇苷（5－O－methylvisammioside）對照品（批號為111523－201509，含量為95.8%），均由中國食品藥品檢定研究院提供。炒防風(fēng)(編號分別為CFF01，CFF02，CFF03，CFF04，CFF05，CFF06，CFF07，CFF08，CFF09，CFF10，安徽省萬生中藥飲片廠)經(jīng)阜陽市食品藥品檢驗檢測中心許世輝主任中藥師鑒定為防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的炒制品；甲醇（分析醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；純化水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Rigol－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇－水(40∶60)；流速：1.0 mL／min；柱溫：35℃；檢測波長：254 nm；進樣量：5 μL。理論板數(shù)按升麻素苷峰計算應(yīng)不低于4 000。在此色譜條件下，樣品中升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷能達到有效分離。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

對照品貯備液：取升麻素苷對照品15.39 mg，5－O－甲基維斯阿米醇苷14.85 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶液，超聲溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.292 4 g／L的升麻素苷對照品溶液和0.284 5 g／L的5－O－甲基維斯阿米醇苷混合對照品溶液。

供試品溶液：取炒防風(fēng)粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，精密稱定，加熱回流2 h，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷混合對照品溶液1.0，2.0，2.5，5.0，10.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容，搖勻，再加入貯備液，得6個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按擬訂色譜條件測定，以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得回歸方程Y＝119.706 4 X＋0.038 29（r＝0.9994），Y＝135.704 5 X＋0.083 54（r＝0.999 4）。結(jié)果表明，升麻素苷的質(zhì)量濃度在0.011 6～0.292 0 g／L范圍內(nèi)，5－O－甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度在0.011 4～0.285 0 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取線性關(guān)系考察項下稀釋10倍的混合對照品溶液，依法連續(xù)進樣5次，每次5 μL。結(jié)果麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為1.309%和1.347%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取炒防風(fēng)(編號為CFF02)約0.5 g，按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣。結(jié)果麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷的平均含量為0.234 5%和0.205 1%，RSD分別為1.895%和2.058%(n＝6)，表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗：取炒防風(fēng)(編號為CFF02)約0.5 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時按擬訂色譜條件進行分析。結(jié)果麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.993 7%和0.996 4%(n＝6)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取炒防風(fēng)(編號為CFF02)6份，各0.25 g，精密稱定，分別置100 mL具塞錐形瓶中，再分別加入2.2項下混合對照品貯備液各2.0 mL，按2.2項下方法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件依法測定。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取10批不同產(chǎn)地的炒防風(fēng)各0.5 g，每批2份，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行分析。精密量取供試品溶液5 μL，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)一點法計算各批炒防風(fēng)含量。結(jié)果見表2。可見，不同產(chǎn)地炒防風(fēng)所含的麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷差異較大，可能與各地氣候條件、土壤狀況、緯度、海拔、高度、日照強度、栽培條件、采集季節(jié)及藥材的儲存條件等因素不同有關(guān)[5]。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

防風(fēng)中主要含有色原酮類物質(zhì)，常見的色原酮包括升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷等。2015年版《中國藥典（一部）》中，防風(fēng)項下有關(guān)于二者的含量測定，但炒防風(fēng)未見相關(guān)報道。參考2015年版《中國藥典（一部）》防風(fēng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，選擇升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷作為炒防風(fēng)的質(zhì)量控制指標(biāo)，為進一步研究其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)參考。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果(%)

3.2 測定波長的選擇

經(jīng)在線全波長紫外吸收光譜掃描分析，上述2個分析物在254 nm波長處有良好的紫外吸收強度。本研究中，采用254 nm作為檢測波長時，升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷同時成為主要吸收峰，分離度好，峰形良好，且其他物質(zhì)對二者的測定無干擾，故選擇254 nm作為測定波長。

3.3 流動相的選擇

分別比較了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.1%磷酸水等流動相，結(jié)果以甲醇－水作為流動相時基線較平穩(wěn)，且對色譜柱損傷小，各色譜峰的分離度和理論板數(shù)均能達到要求，且其他物質(zhì)對麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷的測定無干擾，最終采用甲醇－水作為流動相。

3.4 提取方法的選擇

考察了以甲醇、乙醇、50%甲醇為提取溶劑的提取方法，結(jié)果甲醇的提取效率高于乙醇和50%甲醇。由于炒防風(fēng)中含有大量的多糖[15]和單寧等，難以直接進行HPLC分析。采用甲醇為提取溶劑，樣品較清潔，又兼顧了甲醇對色原酮提取效率高的特性。故選擇甲醇為提取溶劑。

3.5 方法的適用性

本試驗所建立的HPLC法經(jīng)方法學(xué)驗證，具有方便、快捷、準(zhǔn)確、簡便、重復(fù)性好等特點，可用于炒防風(fēng)的質(zhì)量控制，亦為含有炒防風(fēng)的成方制劑的質(zhì)量控制提供了參考。含量測定結(jié)果表明，不同批次的炒防風(fēng)中二者的含量差異較大。

3.6 不足

中藥發(fā)揮療效是其所含有的化學(xué)物質(zhì)共同作用的結(jié)果。限于條件，本試驗中只測定了炒防風(fēng)中所含色原酮類物質(zhì)中的2種，因防風(fēng)經(jīng)過炒制后，化學(xué)成分會發(fā)生一定變化，其他色原酮類物質(zhì)如升麻素、亥茅酚苷等暫未進行研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部）[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015：149－150.

[2]丁安榮，王奇志，李淑莉，等.防風(fēng)化學(xué)成分的研究[J].中草藥，1987，18（6）：7－9.

[3]趙博，楊鑫寶，張連學(xué)，等.防風(fēng)靈——防風(fēng)中1個新的香豆素類化合物[J].中國中藥雜志，2010，35（11）：1418－1420.

[4]趙博，楊鑫寶，張連學(xué)，等.防風(fēng)化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志，2010，35（12）：1569－1572.

[5]夏倫祝，彭代銀，汪永忠，等.三種方法提取防風(fēng)揮發(fā)油的氣質(zhì)聯(lián)用成分分析[J].安徽醫(yī)藥，2009，13（8）：885－886.

[6]陳勇，李曉如，曾笑，等.氣相色譜－質(zhì)譜和化學(xué)計量學(xué)解析法分析防風(fēng)揮發(fā)油成分[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（6）：500－502.

[7]嚴(yán)云麗，張華，金高娃，等.防風(fēng)揮發(fā)油化學(xué)成分分析比較[J].世界科學(xué)技術(shù)－中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2009，11（3）：400－406.

[8]李洪峰，于英，金星海，等.不同產(chǎn)地防風(fēng)中揮發(fā)油成分分析[J].黑龍江水專學(xué)報，2007，34（4）：101－104.

[9]王松柏，秦雪梅，劉煥蓉，等.防風(fēng)多糖化學(xué)成分的研究[J].化學(xué)研究，2008，19（2）：66－68.

[10]薛寶文，李文，李麗，等.防風(fēng)色原酮甙類成分的藥理活性研究[J].中國中藥雜志，2000，25（5）：297－299.

[11]高鴻霞，邵世和，王國慶.中藥防風(fēng)的研究進展[J].井岡山醫(yī)專學(xué)報，2004，11（4）：12－14.

[12]楊波，曹玲，王喜軍.CO2超臨界萃取物的藥效學(xué)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2006，34（1）：14－15.

[13]胡紫艷，馮振斌，蔣健.HPLC測定不同產(chǎn)地防風(fēng)中4種有效成分的含量[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2016，13（11）：31－34.

[14]邵留英，喻志斌，瞿發(fā)林.不同產(chǎn)地防風(fēng)中有效成分含量比較[J].海峽藥學(xué)，2013，25（2）：52－54.

[15]趙博，楊鑫寶，楊秀偉，等.HPLC法同時測定防風(fēng)中6個主要成分的含量[J].藥物分析雜志，2013，33（3）：382－387.