桔?？傇碥諏M2.5致肺損傷大鼠表面活性物質(zhì)相關蛋白A表達的影響

姚琳，張俊威，孟慶杰，董坤，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江哈爾濱150036）

PM2.5是大氣污染的主要來源，已成為影響人類生存環(huán)境和身體健康的主要因素。其粒徑小，可隨氣流進入呼吸道深部，沉積在終末細支氣管和肺泡，其中的超細顆粒物甚至可通過肺泡進入體循環(huán)，對機體造成損傷。越來越多的流行病學和毒理學研究資料表明，PM2.5與人類呼吸道疾病、肺癌和慢性心肺疾病的發(fā)病率密切相關[1－3]。肺泡Ⅱ型上皮細胞(AEC－Ⅱ)是肺泡上皮的干細胞，是合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)及其相關蛋白的主要細胞[4]。AEC－Ⅱ損傷后，可誘導上皮通透性增加，降低表面活性物質(zhì)相關蛋白（SP－A）的合成和分泌[5]。SP－A是由AEC－Ⅱ合成并分泌到肺泡腔中的膠原糖蛋白，能降低肺泡的液－氣界面表面張力，防止肺泡在低肺容量時塌陷，對于維持肺的正常功能至關重要[6－7]。已有研究報道，PM2.5可降低大鼠肺組織中SP－A的表達水平，提示AEC－Ⅱ受損[8]。桔梗為桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根，具有宣肺利咽、祛痰排膿的功效，是治療呼吸系統(tǒng)疾病的常用中藥，其主要活性成分為桔?？傇碥?。本研究中通過對PM2.5模型的復制，探討桔梗總皂苷對PM2.5致肺損傷大鼠SP－A表達的影響，以及對AEC－Ⅱ的修復作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：SorvaⅡST16型低溫離心機（Thermo公司）；KD－TS3A型自動組織脫水機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；KD－BM型生物組織包埋機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；RM2235型組織切片機（德國徠卡公司）；BX4－1型生物顯微鏡，DP－72型組織生物信號采集分析系統(tǒng)（Olympus公司)；Infinite M200 Pro型酶標儀（Tecan公司）；9600型定量PCR檢測儀（杭州博日科技有限公司）；VersaDoc 400mp型凝膠成像系統(tǒng)，PowerPac Universal型電泳儀，半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO－RAD公司）；DYCZ－24DN型電泳槽（北京六一儀器廠）。

試藥：TRIzol試劑（美國Invitrogen公司，批號為66211）；Transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit（Roche公司，批號為1485422）；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，Roche公司，批號為10277200）；SP－A、β－actin引物（哈爾濱博仕生物技術有限公司）；SP－A多克隆抗體（SANTA公司）；高效RIPA組織／細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；PMSF（Calbiochem公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒（碧云天公司）；PVDF膜（Millipore公司）；SP－A檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗法，SEA890Ra 96T，L140724594，Uscn）。桔梗（安國市奉義中藥飲片有限公司，批號為20141020），經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學院王偉明研究員鑒定為正品，桔?？傇碥占兌葹?4.62%；試藥在給藥前研磨成粉，溶解，渦旋混勻。

動物：180～220 g Wistar大鼠50只，雌雄各半，由長春億斯實驗動物技術有限公司提供，SPF級，實驗動物許可證號為SCXK（吉）2011－0004。

PM2.5：PM2.5濾膜由哈爾濱市環(huán)境監(jiān)測站提供。濾膜經(jīng)超聲洗脫處理后，收集PM2.5溶液，真空冷凍干燥后－20℃保存。臨用前，用生理鹽水配成質(zhì)量濃度為10 g／L的PM2.5混懸液。

1.2 方法

動物分組、造模及給藥：將50只Wistar大鼠隨機分為5組，即空白對照組(A組)，模型對照組(B組)，PGS高、中、低劑量(C1，C2，C3)組，各10只，雌雄各半。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，除A組外，其余各組采用氣管滴注法進行染毒，染毒劑量為10 mg／kg，每日1次，連續(xù)5 d。染毒第6天開始灌胃給藥，每日1次，A組和B組灌胃等量生理鹽水；C1，C2，C3組給藥劑量56，28，14mg／kg，每日1次，連續(xù)給藥14d。第14天給藥后1h，予1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，分離血清－80℃凍存，用于檢驗血清中SP－A含量；收集肺泡灌洗液(BALF)，于－80℃凍存?zhèn)溆?，用于檢驗BALF中SP－A含量；剪取左肺組織，4%甲醛固定，用于HE染色；取右肺組織中葉，用于提取RNA和蛋白質(zhì)。

HE染色試驗：取甲醛固定的肺組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯中透明2次，放入石蠟內(nèi)進行包埋。蠟塊修好后固定于石蠟切片機上，切片，將完全展開的蠟片貼附于清潔載玻片上，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下進行病理組織學檢查。

大鼠肺組織SP－A mRNA檢測：以實時熒光定量PCR法檢測SP－A mRNA的表達。提取RNA，用酶標儀對RNA純度及濃度進行測定，根據(jù)RNA濃度調(diào)整總RNA的體積，使各樣品逆轉(zhuǎn)錄體系所含的RNA量相同，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進行聚合酶鏈反應。引物序列[9]：SP－A上游5′－TAA GTG CTG CCC TCT GAC CT－3′，下游5′－AGG AGC CAT ACA TGC CAA AC－3′；β－actin上游5′－CGT TGA CAT CCG TAA AGA C－3′，下游5′－TGG AAG GTG GAC AGT GAG－3′。

大鼠肺組織SP－A蛋白檢測：按試劑盒操作步驟提取，檢測蛋白濃度，相同蛋白濃度加入12%SDS PAGE凝膠，分離，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉3 h，加入一抗稀釋液4℃孵育，過夜，然后將膜與二抗稀釋液在室溫下?lián)u床孵育1 h。最后用化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像儀中拍照。

大鼠血清及BALF中SP－A測定：采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測，根據(jù)預試驗，血清和BALF樣品分別稀釋100，1 000倍后測定，操作程序按ELISA試劑盒要求進行。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件分析，計量數(shù)據(jù)用X±s表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺組織病理變化

剖檢時可見，B組大鼠肺部病變明顯，外觀充血、水腫，嚴重者肺葉分布散在大小不等的壞死灶，病變程度以模型組最重；病理學檢查顯示，病變主要在肺內(nèi)，病變性質(zhì)為間質(zhì)性肺炎和細支氣管肺炎，肺纖維增生，肺間質(zhì)炎性細胞浸潤，支氣管及血管周圍有明顯的淋巴細胞浸潤，肺泡結構不完整，排列不規(guī)則，肺泡上皮細胞脫落。A組大鼠肺組織基本正常。C1，C2，C3組大鼠的肺組織相對于B組，上述病變明顯減輕，且間質(zhì)性肺炎的程度隨著劑量的增加而逐漸減輕，C1組與A組相近。結果見圖1?？梢?，PGS具有改善PM2.5致肺損傷的作用，使肺組織病變程度明顯減輕。

圖1 各組大鼠肺組織病理檢測結果(HE×10)

2.2 大鼠肺組織SP－A mRNA和蛋白的表達

與A組比較，B組SP－A mRNA和蛋白的表達顯著下調(diào)（P＜0.01）；與B組比較，C1，C2，C3組增加SP－A mRNA和蛋白的表達，尤其以C1，C2組差異顯著（P＜0.01，P＜0.05），且C1組上調(diào)明顯。詳見表1和圖2。

表1 各組大鼠肺組織中SP－A mRNA和蛋白表達比較（s，n＝10）

表1 各組大鼠肺組織中SP－A mRNA和蛋白表達比較（s，n＝10）

注：與A組比較， P＜0.01；與B組比較， P＜0.05， P＜0.01。表2同。

蛋白(SP－A／ －actin)0.86±0.09 0.28±0.10 0.71±0.08 0.52±0.12 0.36±0.10組別A組B組C1組C2組C3組劑量[mg／（kg·d）]56 28 14 mRNA（SP－A／ －actin）0.978±0.023 0.261±0.006 0.783±0.018 0.516±0.036 0.331±0.043

圖2 各組大鼠肺組織SP－A蛋白表達

2.3 大鼠血清及BALF中SP－A的含量測定

與A組比較，B組大鼠血清中SP－A含量明顯上調(diào)（P＜0.05），而BALF中SP－A含量下降（P＜0.05）；與B組大鼠相比，C1，C2，C3組大鼠血清中SP－A含量下調(diào)，其中C1，C2組下調(diào)顯著（P＜0.05），BALF中SP－A含量均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清及BALF中SP－A含量比較（s，n＝10）

表2 各組大鼠血清及BALF中SP－A含量比較（s，n＝10）

組別A組B組C1組C2組C3組劑量[mg／（kg·d）]56 28 14血清（ng／mL）9.638±0.926 12.332±0.759 9.105±1.639 9.427±1.934 11.309±2.118 BALF（ng／mL）565.32±63.55 453.76±57.41 629.25±54.73 587.92±58.36 561.33±60.97

3 討論

PM2.5對肺組織的影響[10－12]，其病理學變化主要表現(xiàn)為炎性改變，肺間質(zhì)有大量的炎性細胞浸潤，肺間隔增厚，毛細血管受損，細支氣管和毛細血管周圍亦有大量的炎性細胞浸潤。本試驗中PM2.5致肺損傷的模型復制再次驗證，其對肺損傷的作用，同時也證實，桔?？傇碥湛擅黠@減輕PM2.5致大鼠肺組織的炎癥表現(xiàn)，肺組織形態(tài)結構趨向于正常，損傷得到修復。

大量炎性細胞的產(chǎn)生，一方面可抑制SP－A的基因表達[13]，另一方面可使AEC－Ⅱ凋亡、裂解、壞死，AEC－Ⅱ數(shù)目減少，且不能及時得到更新，進一步導致SP－A表達下調(diào)。隨著SP－A mRNA下調(diào)效應的積累、疊加與放大，其蛋白表達也逐漸下降。給藥后，藥物使炎性細胞數(shù)量下降，炎性細胞對SP－A mRNA的抑制作用減弱，且AEC－Ⅱ得到修復、增生，使SP－A mRNA表達增強，同時隨著SP－A基因表達的增多，被翻譯蛋白量增加，其蛋白表達提高。

SP－A的合成和分泌具有一定的肺特異性，主要由AEC－Ⅱ表達。正常情況下，SP－A在血液中是不表達或表達很微量的，但當肺泡上皮細胞和周圍毛細血管受到炎性細胞的浸潤而造成不同程度的損傷時，肺泡毛細血管通透性增加，SP－A滲漏到肺泡毛細血管中并隨血液流入血循環(huán)[14]，導致SP－A水平在體循環(huán)血液中上升，故血清中SP－A的水平可反應肺損傷的嚴重程度。

本試驗結果表明，PM2.5可使大鼠BALF中SP－A含量下降，而使血清中SP－A含量增加，提示PM2.5可導致AEC－Ⅱ及毛細血管受損。而PGS各劑量均能增加BALF中SP－A含量，并降低血清中SP－A含量，提示PGS對受損的AEC－Ⅱ及毛細血管具有一定的修復作用，且能恢復AEC－Ⅱ的正常合成和分泌SP－A的功能。

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