柴胡皂苷D對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞增殖抑制作用研究

楊春艷，范文翔，歐學(xué)蘭，袁斌

（川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所·川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充637000）

骨肉瘤是兒童和青少年常見的骨惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移早的特點(diǎn)。雖然目前采用聯(lián)合化療及手術(shù)綜合治療后患者的5年生存率提高到60%～70%，但仍有患者效果不佳，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍達(dá)30%～40%[1]?？晒┻x擇的臨床化療藥物有限，而且大多數(shù)都存在耐藥性。柴胡是傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根[2]。其最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，味苦、辛，性微寒，歸肝、膽經(jīng)，具有退熱解表、疏肝解郁、升舉清氣的功效，由柴胡組成的經(jīng)典古方有數(shù)百首[3]。其主要化學(xué)成分和生物活性成分為柴胡皂苷（saikosaponins，SS）。柴胡皂苷屬環(huán)氧醚型五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物，對(duì)胃癌、肺癌、前列腺癌及肝癌具有抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等抗腫瘤作用[4－7]，而柴胡皂苷應(yīng)用于治療骨肉瘤的研究報(bào)道極少。本研究中通過研究柴胡皂苷單體柴胡皂苷D(SS－d)對(duì)人骨肉瘤143B細(xì)胞增殖的影響，為柴胡皂苷單體今后用于骨肉瘤的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：熒光CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；Spectramax 190型酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；Micro17R型高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

細(xì)胞株及試藥：143B細(xì)胞株（中橋新舟生物科技有限公司）；柴胡皂苷D（中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所）；注射用鹽酸多柔比星（海正輝瑞制藥有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone公司）；骨鈣素(OCN)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、堿性磷酸酶(AKP)測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑配置及分組

柴胡皂苷D濃度配置：取柴胡皂苷D 13 mg，分別加入166 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解，充分混勻，制成終濃度為100 mmol／L的母藥溶液，4℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)加入DMEM培養(yǎng)基，將其稀釋至相應(yīng)濃度，備用。

分組：設(shè)置陰性對(duì)照組（A組，加入同體積培養(yǎng)液），陽(yáng)性對(duì)照組（B組，加10 μg／mL多柔比星），藥物組（C1，C2，C3，C4，C5，C6組，分別加6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00 μmol／L柴胡皂苷D）。

1.2.2 試驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)：143B細(xì)胞體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U／L青霉素、100 μg／L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置5%CO2及37℃條件下二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性：用培養(yǎng)基調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液濃度為1×104個(gè)／mL，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的143B細(xì)胞按1×105個(gè)／mL的密度接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL；37℃培養(yǎng)24 h后加入柴胡皂苷D進(jìn)行干預(yù)，分別設(shè)藥物組（C1，C2，C3，C4，C5，C6組，柴胡皂苷D梯度濃度為6.25，12.5，25，50，100，200 μmol／L）和對(duì)照組（A組，不加藥組），10 μg／mL多柔比星組(B組)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)，并于6，12，24，48，72 h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞增殖曲線。

143B細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察：在MTT試驗(yàn)中，加藥前后分別用倒置相差顯微鏡觀察不同濃度柴胡皂苷D（6.25，12.5，25，50，100，200 μmol／L）作用不同時(shí)間（6，12，24，48，72 h）后，各組培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況、形狀、密度及凋亡的細(xì)胞等。

樣本中AKP活力檢測(cè)：將143B細(xì)胞以1×105個(gè)／mL密度接種于24孔板中，24 h后分別加入含不同藥物、不同濃度柴胡皂苷D培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在6，12，24，48 h后吸取1 mL上清液置Ep管中，用離心機(jī)離心，吸取上清液保存。按AKP測(cè)試盒說明書進(jìn)行操作，步驟見表1。輕輕振搖檢測(cè)板，混勻孔板，在520 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的光密度(OD)值。參照試劑說明書計(jì)算公式計(jì)算AKP活力。

樣本中OCN表達(dá)檢測(cè)：按上述操作培養(yǎng)143B細(xì)胞，加柴胡皂苷D(終濃度為50 μmol／L)，在藥物作用6，12，24，48 h后收集各孔中的培養(yǎng)液，以1 600 r／min的速率離心4 min，收集上清液，并封存于－80℃冰箱。參照骨鈣素酶聯(lián)免疫吸咐(ELISA)檢測(cè)試劑盒說明，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和檢測(cè)樣品孔，按清洗、顯色、終止、檢測(cè)步驟操作，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程，計(jì)算樣品的濃度。

表1 AKP活力檢測(cè)步驟（ L）

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（表示，各組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞增殖的抑制

柴胡皂苷D作用143B細(xì)胞6 h后，細(xì)胞活力顯著降低，且隨著濃度的增加其生存率逐漸降低，隨著時(shí)間的增加其生存率有輕微下降。用藥6，12，24，72 h后，除6.25 μmol／L濃度組以外，其他藥物濃度組與對(duì)照組比較差異，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。48 h后，所有藥物濃度組間差距均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。24，48 h后，陽(yáng)性對(duì)照藥多柔比星也有明顯抑制作用，與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。48 h后的25 μmol／L濃度組與72 h后的50 μmol／L濃度組細(xì)胞活性最低。詳見表2和圖1。

2.2 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞中AKP活力的影響

AKP是成骨分化的重要標(biāo)志之一。由表3可見，柴胡皂苷D對(duì)AKP的表達(dá)并無明顯影響，提示柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞的增殖抑制可能不是由促成骨分化作用造成的。而同一組藥物隨著時(shí)間的變化AKP活力改變也不明顯，這可能與藥物作用太強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞在6 h時(shí)就大量死亡有關(guān)。

表2 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞活力的影響（s，n＝3）

表2 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞活力的影響（s，n＝3）

注：與對(duì)照組相比， P＜0.05。

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圖1 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞的抑制作用

2.3 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞中OCN含量的影響

由表4可見，柴胡皂苷D作用于143B細(xì)胞后，人骨鈣素含量均下降，50 μmol／L濃度的柴胡皂苷D作用24 h后人骨鈣素含量最低，為（0.59±0.002）ng／mL（P＜0.05）。同一藥物組隨著時(shí)間的變化人骨鈣素含量差異較小，可能與細(xì)胞大量死亡有關(guān)。

2.4 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞形態(tài)的影響

柴胡皂苷D作用于143B細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度的增大，細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞核變小、固縮，全面皺縮，細(xì)胞膜破裂，由此可推斷出，143B細(xì)胞的凋亡可能由柴胡皂苷D改變細(xì)胞膜的通透性而引起。詳見圖2。

3 討論

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)柴胡皂苷的藥理活性研究逐漸增多，已證實(shí)了柴胡皂苷在鎮(zhèn)靜、抗驚厥、解熱、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保肝護(hù)腎，以及抗腫瘤等多方面具有良好的藥理學(xué)作用[8]。研究還表明，柴胡皂苷D是活性最強(qiáng)的單體，其發(fā)揮抗腫瘤作用[9]可能與以下幾種方式有關(guān)：免疫調(diào)節(jié)作用；抑制腫瘤細(xì)胞的分裂與生長(zhǎng)；誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；抑制環(huán)氧合酶。柴胡皂苷是柴胡的毒性成分，具有肝毒性，不同產(chǎn)地、不同炮制方法、不同提取方法都對(duì)其毒性有影響，這主要是因?yàn)槠浜坎灰恢略斐傻?。相比于其他抗腫瘤藥物的高毒性、耐藥性，柴胡皂苷仍具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

表3 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞AKP活力的影響（s，金氏單位／100 mL，n＝3）

表3 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞AKP活力的影響（s，金氏單位／100 mL，n＝3）

注：與正常細(xì)胞組相比， P＜0.05。

組別正常細(xì)胞組柴胡皂苷D（50 mol／L）組6 h 0.86±0.13 1.13±0.01 12 h 1.08±0.02 1.03±0.17 24 h 1.12±012 1.17±0.04 48 h 1.18±0.07 1.22±0.06

表4 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞人OCN含量的影響[s，ng／mL，n＝3]

表4 柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞人OCN含量的影響[s，ng／mL，n＝3]

注：與正常細(xì)胞組相比， P＜0.05。

組別正常細(xì)胞組柴胡皂苷D（50 mol／L）組6 h 0.99±0.03 0.73±0.71 12 h 1.34±0.08 0.61±0.08 24 h 1.23±0.001 0.59±0.002 48 h 1.20±0.07 0.66±0.21

圖2 加入柴胡皂苷D后的細(xì)胞形態(tài)變化

本研究中，采用不同濃度的柴胡皂苷D在體外作用于骨肉瘤143B細(xì)胞，通過MTT檢測(cè)法發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)，且呈一定的濃度相關(guān)性，但隨著時(shí)間的變化，作用改變不太明顯。顯微鏡下觀察柴胡皂苷D引起細(xì)胞形態(tài)明顯改變，細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂。這可能與李濤等[10]通過體外研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷D的肝毒性并非簡(jiǎn)單的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而是柴胡皂苷D誘導(dǎo)了細(xì)胞膜通透性的改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死這一結(jié)論有關(guān)。

皂苷類藥物還具有較強(qiáng)的溶血作用，這可能與143B細(xì)胞快速凋亡有關(guān)。為了進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率，考察柴胡皂苷D是否有促凋亡作用及有影響細(xì)胞周期的作用，若不具有促凋亡作用，則可進(jìn)一步進(jìn)行乳酸脫氫酶釋放率試驗(yàn)考察柴胡皂苷D對(duì)143B細(xì)胞膜的損傷作用。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)柴胡皂苷D作用后AKP的活力變化較小，而人骨鈣素的含量降低說明柴胡皂苷D抑制143B細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與促分化作用關(guān)系不大，與腫瘤細(xì)胞的凋亡和基因的調(diào)控關(guān)系很大。已有研究表明，脂肪酸合成酶(FAS)在骨肉瘤組織中過表達(dá)，可以作為治療骨肉瘤疾病的新靶位[11]。有許多體內(nèi)和體外試驗(yàn)表明，F(xiàn)AS抑制劑能抑制腫瘤生長(zhǎng)[12－14]。后續(xù)試驗(yàn)可以檢測(cè)FAS基因的表達(dá)情況來驗(yàn)證其作用機(jī)制。有學(xué)者認(rèn)為，bcl－2／bax的比值是促使腫瘤細(xì)胞凋亡的重要原因，其中bcl－2是抑制凋亡的基因，bax是促進(jìn)凋亡的基因[15]，可將其作為下一步考察的指標(biāo)。

綜上所述，雖然柴胡皂苷能顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，但其主要作用機(jī)制還需要試驗(yàn)研究，其在體內(nèi)的活性情況也有待研究。隨著對(duì)皂苷抗癌作用研究的深入，有望在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，利用現(xiàn)代分子藥理學(xué)及分子生物學(xué)提取篩選其有效成分，開發(fā)出新的抗腫瘤藥物。

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