Wnt信號通路上關(guān)鍵基因在哈薩克族食管癌中的表達(dá)*

張靜， 閆新玲， 馬遇慶， 羅丹， 張亞靜

830000 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 病理科 (張靜、羅丹、張亞靜)；830000 烏魯木齊，烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院 病理科(閆新玲)；830054 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科(馬遇慶)

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]食管癌依據(jù)WHO組織學(xué)分類主要包括鱗癌和腺癌兩種，其中鱗癌占90%。我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，占全國腫瘤死亡率21.8%[2]。新疆哈薩克族食管癌發(fā)病率明顯高于其他民族。食管癌的癌變是一個多步驟、多因素的過程，其發(fā)生發(fā)展過程與多種基因的異常表達(dá)有關(guān)[3]。Wnt信號通路是由Wnt蛋白及其受體、調(diào)節(jié)蛋白等組成的復(fù)雜信號途徑,是調(diào)節(jié)增殖生長的關(guān)鍵途徑[4],對細(xì)胞增殖、分化和凋亡等起重要的調(diào)控作用。越來越多的證據(jù)表明,Wnt信號途徑異常激活參與了多種人類腫瘤的發(fā)生。因?yàn)槟[瘤分布具有地域差異，歐美國家對此通路的研究多集中于結(jié)腸癌、前列腺癌及乳腺癌中[5-7]，對于該通路在食管癌中的研究相對較少。CK2(蛋白激酶)和SFRP2(泌型卷曲相關(guān)蛋白2)是Wnt信號通路上的關(guān)鍵基因，本文旨在研究食管鱗癌中二者在Wnt信號通路上相互作用及與其他臨床資料的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2007年～2014年在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的原發(fā)性食管鱗癌患者75例，均為哈薩克族，術(shù)前均行鋇餐、B超、活檢等確診為原發(fā)食管鱗癌。75例均表現(xiàn)為不同程度的進(jìn)行性吞咽困難，同時(shí)伴有營養(yǎng)不良，消瘦等癥狀，其中男性51例，女性24例，年齡39～80歲，平均(53±6)歲。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組化染色 將食管鱗癌組織置于65℃烤箱中，2h后脫蠟，水化，用PBS充分沖洗，孵育15min，再次沖洗，用枸緣酸鹽溶浸潤玻片和切片架，高溫加熱，冷卻后PBS沖洗3遍,共10min，鐘；加入1∶200的CK2和SFRP2一抗，置于4℃的環(huán)境下過夜；PBS沖洗，滴加二抗，孵育90min，DNA顯色，常規(guī)脫水，封片。

1.2.2 結(jié)果判定 表達(dá)程度判定標(biāo)準(zhǔn)[8-9]: 免疫組化結(jié)果由2 位病理醫(yī)師共同判定(CK2的Kappa值為0.939，P<0.01；SFRP2的Kappa值為0.877，P<0.01)。雙盲法在每張切片隨機(jī)選取10個高倍視野(400×倍)，每個視野500～1 000個細(xì)胞。從以下2方面對切片進(jìn)行計(jì)分:①染色強(qiáng)度:0分為無著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色;②陽性細(xì)胞數(shù):1分為1%～10%，2分為1l%～50%，3分為51%～75%，4分為≥76%。將兩項(xiàng)評分相乘得出最終結(jié)果:陰性(-):<3分，陽性(+):≥3分。CK2在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞漿表達(dá)，呈褐色或黃褐色顆粒分布。SFRP2在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞漿表達(dá)，呈褐色或黃褐色顆粒分布。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 哈薩克族食管鱗癌的臨床病理特征(表1)

表1 哈薩克族食管鱗癌患者臨床病理特征

2.2 CK2在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)

CK2定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞漿中，見圖1。CK2在食管鱗癌組織中陽性率為68%，在癌旁組織中陽性率為28%，表達(dá)明顯高于癌旁組織，兩者陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 CK2在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.3 哈薩克族食管鱗癌臨床病理參數(shù)與CK2表達(dá)的關(guān)系

CK2表達(dá)與腫瘤浸潤程度相關(guān)(P<0.05), CK2表達(dá)與其他臨床病理參數(shù)無關(guān)(P﹥0.05)。見表3。

表3 哈薩克族食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)與CK2表達(dá)的關(guān)系

(接下表)

(續(xù)上表)

變量哈薩克族CK2-(n=24)CK2+(n=51)x2P值淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.04>0.05 有716 無1735血管侵犯0.05>0.05 有49 無2042神經(jīng)侵犯0.46>0.05 有412 無2039

2.4 SFRP2在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)

SFRP2在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核或細(xì)胞漿表達(dá)，見圖1。食管鱗癌中SFRP2陽性率為29.3%，癌旁組織中陽性率為70.7%，SFRP2在癌旁組織中的表達(dá)明顯高于癌組織，兩者陽性率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4

表4 SFRP2在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.5 哈薩克族食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)與SFRP2表達(dá)的關(guān)系

SFRP2表達(dá)與臨床病理參數(shù)無關(guān)(P>0.05)。見表5。

表5 哈薩克族食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)與SFRP2表達(dá)的關(guān)系

(接下表)

(續(xù)上表)

變量哈薩克族SFRP2-(n=53)SFRP2+(n=22)x2P值類型1.94>0.05 潰瘍型3213 髓質(zhì)型63 縮窄型123 蕈傘型33腫瘤大小0.39>0.05 ≥3cm3312 <3cm2010分化程度1.89>0.05 高114 中3417 低81浸潤深度2.70>0.05 粘膜2112 肌層95 其他235淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.48>0.05 有158 無3814血管侵犯0.04>0.05 有103 無4319神經(jīng)侵犯0.55>0.05 有133 無4019例數(shù)5322

2.6 食管鱗癌中CK2和SFRP2的表達(dá)的相關(guān)性

在哈薩克族食管鱗癌組織中，CK2 和SFRP2均陽性者為11例，CK2陽性而SFRP2陰性者為40

例，CK2陰性而SFRP2陽性者為11例，二者均陰性者13例，兩者呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表6。

表6 食管鱗癌中CK2和SFRP2的表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

近年的臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[8]，食管癌的發(fā)生率、死亡率逐年上升，已經(jīng)成為學(xué)界普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問題。我國每年因食管癌死亡的人數(shù)在15萬以上[9]，且呈逐年遞增趨勢[10]。食管癌的發(fā)病年齡多在40歲以上，女性少于男性。目前食管癌發(fā)病原因尚未明了。在生物進(jìn)化過程中Wnt信號通路是一條極為保守的通路,當(dāng)細(xì)胞分化成熟時(shí)處于關(guān)閉狀態(tài)，近年來研究[11]表明，Wnt信號通路異常可引起人類多種惡性腫瘤。與消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也關(guān)系密切，研究揭示食管癌的發(fā)生、發(fā)展和Wnt信號通路中各成分的變化密不可分。其中CK2和SFRP2是Wnt信號通路上的關(guān)鍵基因。在Wnt通路中，CK2是真核生物細(xì)胞中普遍存在的、多功能蛋白激酶，具有高度多效性，能使細(xì)胞內(nèi)300多種底物磷酸化，對細(xì)胞遷移、增殖、凋亡、分化和血管再生具有重要的作用[12]。CK2作為β-catenin降解復(fù)合物上游的激酶通過β-catenin(β-catenin分子參與多種腫瘤的發(fā)生過程[13-14])對Wnt通路中的靶基因發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，有研究證實(shí)在Wnt通路中,CK2可能發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用[15]。Wnt信號通路的負(fù)性調(diào)控因子SFRP2被認(rèn)為是Wnt信號通路最為強(qiáng)大的拮抗劑[16]。而SFRP作為Wnt信號途徑的抑制劑，其結(jié)構(gòu)與Fz受體極為相似，具有同源的配體抑制區(qū)，通過競爭性結(jié)合Wnt蛋白而抑制Wnt的活動[17]。如果SFRP2表達(dá)下調(diào)或缺失,對Wnt信號通路的抑制作用減弱或消失,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是在食管癌形成過程中所發(fā)揮的作用,目前尚不清楚[18]。CK2和SFRP2聯(lián)合檢測在新疆哈薩克族食管鱗癌的研究很少[19]。本研究發(fā)現(xiàn)：CK2在食道鱗癌中高表達(dá)，在癌旁組織低表達(dá)(P<0.05)，驗(yàn)證了CK2在Wnt通路中可發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用。SFRP2在食道鱗癌中低表達(dá)，在癌旁組織高表達(dá)(P<0.05)，說明作為抑癌基因的SFRP2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中表達(dá)下調(diào)或缺失，失去了對腫瘤的抑制作用，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。這些基因在食管癌及癌旁組織中表達(dá)有差異[20]。在與臨床病理參數(shù)的聯(lián)系中，我們發(fā)現(xiàn)只有CK2與腫瘤的浸潤深度有關(guān)，說明作為Wnt信號通路正向調(diào)節(jié)因子，CK2不斷促進(jìn)腫瘤的浸潤發(fā)展。CK2和SFRP2與其他臨床參數(shù)均無關(guān)，考慮因?yàn)闃颖玖康年P(guān)系，有些關(guān)系并未真實(shí)的展現(xiàn)出來，我們在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步增加樣本量，繼續(xù)探討CK2和SFRP2與臨床參數(shù)的關(guān)系。研究還發(fā)現(xiàn)：在食管鱗癌中CK2和SFRP2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在激活的Wnt通路中Wnt蛋白與細(xì)胞跨膜受體Fz等結(jié)合后,觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號,抑制β-catenin降解復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成,而CK2作為β-catenin降解復(fù)合物上游的激酶可直接或間接使β-catenin磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin積累并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),繼而與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF相結(jié)合,引發(fā)Wnt信號靶基因的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)細(xì)胞生長。而作為Wnt信號途徑的抑制劑的SFRP，其結(jié)構(gòu)與Fz受體極為類似，具備同源的配體抑制區(qū)，通過競爭性結(jié)合Wnt蛋白進(jìn)而阻止Wnt蛋白與Fz的結(jié)合最終抑制Wnt的活動。所以CK2和SFRP2兩者在Wnt通路中功能是拮抗的。與本文結(jié)論一致。

圖1 CK2和SFRP2在食管鱗癌及癌旁組織中的免疫組化表達(dá)

a.ck2癌細(xì)胞核陽性表達(dá)(10×10);b.ck2癌細(xì)胞核陽性表達(dá)(40×10);c.SFRP2癌細(xì)胞漿陽性表達(dá)(10×10);d.SFRP2癌細(xì)胞漿陽性表達(dá)(40×10);e.SFRP2癌旁組織漿陽性表達(dá)(10×10);f.ck2癌旁組織陰性表達(dá)(10×10) ;g.SFRP2癌細(xì)胞陰性表達(dá)(10×10)

綜上所述：食管癌是消化道最為常見的惡性腫瘤之一。在我國食管癌發(fā)病率、死亡率在界范圍內(nèi)均處于較高水平[21]。在食管鱗癌中，CK2高表達(dá)與SFRP2低表達(dá)共同促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SFRP2表達(dá)下調(diào)可能使其拮抗Wnt信號通路的功能減弱， CK2正調(diào)節(jié)Wnt通路中，使Wnt持續(xù)存在，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。CK2和SFRP2可能為預(yù)防食管鱗癌以及食管鱗癌早期診斷和預(yù)后評估提供了新的思路。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測；

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

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