基因芯片技術(shù)在慢性HBV感染者病毒基因分型和耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用及臨床意義

周冬青+王驥+趙嫻+陳輝

[摘要] 目的 采用基因芯片檢測(cè)徐州地區(qū)慢性HBV感染者病毒基因分型和耐藥基因，并研究其應(yīng)用價(jià)值及臨床意義。方法 收集徐州市傳染病醫(yī)院2015年5月—2017年7月在徐州市傳染病醫(yī)院肝炎科就診的34例臨床確診為慢性HBV感染且有抗病毒藥物應(yīng)用史且治療效果不佳患者的臨床資料和患者的血清樣本，采用基因芯片技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行乙肝病毒基因分型和耐藥突變的檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果結(jié)合患者的臨床資料進(jìn)行分析，判斷其應(yīng)用價(jià)值及意義并指導(dǎo)臨床用藥。結(jié)果 34例患者檢出HBV DNA陽(yáng)性為32例，陰性2例，陽(yáng)性患者中HBV-C型患者26例，HBV-B 型患者3例，HBV-B合并HBV-C患者3例；LAM+Ldt耐藥4例，為2例C型、1例B型、1例B、C合并型；LAM+Ldt+ADV 3例，均為HBV-C型患者；LAM+Ldt+ETV耐藥患者5例，均為HBV-C型；總計(jì)12例耐藥患者中含有rtL180M和rtM204I/V突變有8例，rtA181V/T突變有3例，1例為rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G突變，4例除rtL180M和rtM204I/V突變還出現(xiàn)rtS203G/I，還有1例rtL180M和rtS202G/I突變。 結(jié)論 采用基因芯片檢測(cè)乙型肝炎患者的基因分型和耐藥基因，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)指導(dǎo)臨床抗病毒治療具有十分重要的意義。

[關(guān)鍵詞] 基因芯片；乙型肝炎病毒基因型；耐藥基因突變；核苷類(lèi)似物

[中圖分類(lèi)號(hào)] R440 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）10（b）-0034-04

[Abstract] Objective This paper tries to analyze the application and clinical significance of gene chip technology in detection of viral genotypes and resistances genes in chronic HBV infected patients in Xuzhou area. Methods Clinical data and serum samples of 34 patients with chronic HBV infection and antiviral medication history and poor treatment effect from hepatitis department of Xuzhou infectious diseases hospital from May 2015 to July 2017 were studied， detection of hepatitis B virus genotypes and drug resistance mutations by gene chip technology were carried out， the detection results combined with the clinical data of patients were analyzed， its application value and the significance were determined and the clinical therapy was guilded. Results 32 cases were HBV DNA positive among the 34 patients， 2 cases were negative， 26 cases of patients with type HBV-C ， 3 cases of patients with type HBV-B， 3 cases of patients with type HBV-B and HBV-C. 4 cases of LAM+Ldt resistance， 2 cases of type C， 1 case of type B， 1 case of type B and C. 3 cases of patients with LAM+Ldt+ADV， all of which were HBV-C type. 5 cases of patients with LAM+Ldt+ETV resistance were HBV-C type. A total of 8 cases of drug resistance patients containing rtL180M and rtM204I/V mutation in 12 cases， 3 cases of rtA181V/T mutation， 1 case of rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G mutation， 4 cases in rtL180M and rtM204I/V mutations as well as rtS203G/I， and 1 case of rtL180M and rtS202G/I mutation. Conclusion Gene chip for genotyping and drug resistance genes in hepatitis B patients has important application value and is of great significance in guiding clinical anti-virus treatment.

[Key words] Gene chip； Hepatitis B virus genotypes； Drug-resistant gene mutation； Nucleoside analogue

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布，全球約有3.5億感染者。我國(guó)屬于感染的高發(fā)區(qū)，現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9 300萬(wàn)例，每年約有30萬(wàn)死于與HBV相關(guān)的肝臟疾病所致的肝硬化、肝癌等嚴(yán)重肝病[1]。根據(jù)DNA序列差異，目前，HBV可分為A-J 10種基因型[2-3]，其中，我國(guó)以B型和C型為主。不同型別在流行特征，致病性，對(duì)藥物治療反應(yīng)等方面存在差異。針對(duì)慢性HBV感染的治療方法主要是抗病毒治療，目前主要有干擾素和核苷（酸）類(lèi)兩類(lèi)藥物。由于干擾素需要反復(fù)注射，且副作用較多，而核苷（酸）類(lèi)藥物因其抑制病毒復(fù)制能力強(qiáng)、使用方便、耐受性好且療效確切，適用于不同階段的乙肝患者等優(yōu)點(diǎn)，核苷（酸）類(lèi)藥物已是抗HBV治療的主要手段[4]，但是，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，往往會(huì)出現(xiàn)病毒耐藥株[5-6]，因而需要對(duì)病毒耐藥基因進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以指導(dǎo)臨床用藥。目前乙型肝炎病毒基因分型法及耐藥基因檢測(cè)方法大多采用基因擴(kuò)增以后的測(cè)序方法完成，一般的醫(yī)療單位不具備測(cè)序條件，無(wú)法進(jìn)行核酸比對(duì)分析，因而不適于基層醫(yī)院的推廣應(yīng)用。乙肝病毒的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)理使得乙肝病毒變異較為常見(jiàn)。內(nèi)源性和外源性選擇壓力下很容易產(chǎn)生免疫逃避變異株[7-8]?；蛐酒瑸椴捎霉鈱?dǎo)原位合成及顯微印刷將大量特定序列探針密集有序的固定于載體上，通過(guò)多元雜交進(jìn)行定性及定量的方法。微型化、集成化、高通量，平行化及敏感性強(qiáng)為其主要特點(diǎn)[9-10]。為此方便收集徐州市傳染病醫(yī)院2015年5月—2017年7月在徐州市傳染病醫(yī)院肝炎科就診的34例臨床確診為慢性HBV感染且有抗病毒藥物應(yīng)用史且治療效果不佳患者的臨床資料和患者的血清樣本，采用基因芯片技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行乙肝病毒基因分型和耐藥突變的檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果結(jié)合患者的臨床資料進(jìn)行分析，判斷其應(yīng)用價(jià)值及意義并指導(dǎo)臨床用藥，現(xiàn)報(bào)道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便收集34例徐州市傳染病醫(yī)院收治的乙型肝炎患者血液標(biāo)本及臨床資料，所有患者均服用過(guò)核苷類(lèi)似物或正在服用核苷類(lèi)似物進(jìn)行抗病毒治療；其中男性25例，女性9例；年齡31～87歲，平均44.33歲，所有患者均根據(jù)2015年《中國(guó)慢性乙肝防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]具有明確診斷，初次應(yīng)用抗病毒藥物患者除外，HBV DNA含量均大于103。患者清晨空腹采取血液3～5 mL，待測(cè)樣本離心后取血清存放與-20℃冰箱。

1.2 主要儀器和試劑

儀器：核酸提取儀、熒光定量PCR儀、分子雜交儀、冰箱。試劑：核酸提取試劑盒、HBV DNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（福建廈門(mén)安普利生物有限公司，下限為103IU/mL）、乙肝病毒基因分型及耐藥檢測(cè)基因芯片。

1.3 方法

26例患者的血清標(biāo)本均采用熒光定量PCR和基因芯片2種方法進(jìn)行檢測(cè)，將2種方法檢測(cè)的結(jié)果結(jié)合患者的臨床資料與其他實(shí)驗(yàn)室檢查（肝功能、血清免疫標(biāo)志物、肝纖維檢測(cè)等）結(jié)果綜合分析，判斷其應(yīng)用價(jià)值，以便根據(jù)檢測(cè)結(jié)果更合理地為患者用藥。核酸提取及熒光定量PCR檢測(cè)方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作?；蛐酒夹g(shù)檢測(cè)乙肝病毒基因分型及耐藥基因亦嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)室條件，進(jìn)行優(yōu)化操作方法，保證檢測(cè)結(jié)果可信，具體包括以下操作步驟：①DNA提?。喝?0 μL蛋白酶K加入編號(hào)的1.5 mL離心管中，然后加入200 μL血清和200 μL裂解液，上下顛倒混勻；置56℃恒溫水浴中10 min后加入300 μL無(wú)水乙醇并混勻，緩慢轉(zhuǎn)移上述液體至離心柱中央，12 000 rpm離心1 min，棄濾液加入700 μL洗液Ⅰ（用前加入無(wú)水乙醇），洗滌后棄濾液，加入700 μL無(wú)水乙醇，棄濾液，干燥，洗脫，保存?zhèn)溆谩＂赑CR擴(kuò)增：取出含PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR管，編號(hào)后離心5 s，加入待測(cè)樣本1.5 μL，5 000 rpm離心2 s，放入PCR儀擴(kuò)增，PCR程序設(shè)置：50℃ 2 min，95℃10 min；94℃ 60 s+68℃ 90 s 30個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s+54℃ 30 s+72℃ 30 s 30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，12℃保存。③雜交、結(jié)果判讀：膜條、6 mL的A液和對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物加入離心管，沸水浴10 min變性，取出離心管放入雜交箱進(jìn)行雜交，將膜條放入B液洗滌，放入孵育液室溫孵育，膜條放入A液搖洗2次，放入C液洗滌1次，現(xiàn)配顯色液，避光顯色；純凈水或去離子水洗滌至少1次，判讀結(jié)果，4℃保存膜條。④結(jié)果判讀：rt180M和rt204I/V、rt204I/V、rt181V/T、rt207I位點(diǎn)突變?yōu)槔追蚨ǎ↙AM）耐藥，rt180M和rt204I/V、rt204I/V、rt181V/T位點(diǎn)突變?yōu)樘姹确蚨ǎ↙dt）耐藥，rt181V/T和rt236T突變?yōu)榘⒌赂ｍf酯（ADV）耐藥，rt180M和rt204I/V、rt204I/V以及rt184I/S/A/F/L/G、rt250I/L/V、rt202G/I位點(diǎn)突變?yōu)槎魈婵f（ETV）耐藥。

2 結(jié)果

34例患者檢出HBV DNA陽(yáng)性為32例，陰性2例，陽(yáng)性率94.11%，與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果基本一致。

32例陽(yáng)性患者中HBV-C型患者26例，HBV-B 型患者3例，HBV-B合并HBV-C患者3例，HBV-B 型患者3例，HBV-B合并HBV-C患者3例與。說(shuō)明徐州地區(qū)患者主要。

34例患者檢出12例耐藥患者，耐藥檢出率35.2%，其中LAM+Ldt耐藥4例，為2例C型、1例B型、1例B、C合并型；LAM+Ldt+ADV耐藥3例，均為HBV-C型患者；LAM+Ldt+ETV耐藥患者5例均為C型。

12例出現(xiàn)基因突變的耐藥患者中rtL180M和rtM204I/V突變有8例，rtA181V/T突變有3例，1例為rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G突變，4例除rtL180M和rtM204I/V突變還出現(xiàn)rtS203G/I，還有1例rtL180M和rtS202G/I突變。這12例耐藥突變患者曾長(zhǎng)期使用核苷類(lèi)似物進(jìn)行抗病毒治療，起初效果較好，肝功能較快恢復(fù)正常，HBV-DNA下降速度較快，患者用藥48周后出現(xiàn)肝功能異常，HBV-DNA大于104，甚至高達(dá)106，ALT反復(fù)異常，患者病情出現(xiàn)了反跳，因此檢測(cè)結(jié)果與臨床基本一致。

采用基因芯片檢測(cè)乙型肝炎患者的基因分型和耐藥基因，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)指導(dǎo)臨床抗病毒治療具有十分重要的意義。

3 討論

目前乙型肝炎病毒耐藥變異的檢測(cè)與分析主要有以下幾種方法：①PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法：該技術(shù)一次可準(zhǔn)確測(cè)序HBV逆轉(zhuǎn)錄酶A-E區(qū)的全長(zhǎng)549bp，通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)全部已知和可能的耐藥變異位點(diǎn)。但是該法靈敏度較差，只有當(dāng)變異株超過(guò)20%時(shí)才能被發(fā)現(xiàn)。②聚合酶聯(lián)反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性：該方法敏感性較強(qiáng)，可檢測(cè)數(shù)量為5%耐藥變異株，然而只能檢測(cè)單位點(diǎn)變異，隨著多種核苷類(lèi)似物的應(yīng)用和HBV變異位點(diǎn)的不斷出現(xiàn)，該方法難以滿足臨床要求。③反向雜交法：該法敏感性較強(qiáng)，可檢測(cè)占HBV準(zhǔn)種池5%～10%的耐藥變異樣品，信息量大，自動(dòng)化高。但儀器、試劑昂貴，操作復(fù)雜，因此難以用于臨床。④實(shí)時(shí)PCR方法：該法可檢測(cè)變異率大于10%的耐藥變異，但僅能檢測(cè)單位點(diǎn)變異。⑤基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜：該技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的一種軟電離新型質(zhì)譜，已成為檢測(cè)鑒定多糖、蛋白質(zhì)、核酸、糖蛋白等有力工具，具有靈敏性高、準(zhǔn)確、分辨率高特點(diǎn)，可發(fā)現(xiàn)數(shù)量不足1%HBV變異株，但設(shè)備昂貴、難以應(yīng)用于臨床?；蛐酒且环N新型檢測(cè)技術(shù)，與上述其他各種方法比較，不但具有快速、高效、敏感、平行化、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，而且不需要昂貴的測(cè)序儀、激光解吸電離時(shí)間質(zhì)譜儀等儀器，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果判斷直觀可見(jiàn)。endprint

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)12例出現(xiàn)基因突變的耐藥患者中rtL180M和rtM204I/V突變有8例，rtA181V/T突變有3例，1例為rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G突變，4例除rtL180M和rtM204I/V突變還出現(xiàn)rtS203G/I，還有1例rtL180M和rtS202G/I突變。說(shuō)明rtL180M和rtM204I/V是最常見(jiàn)的基因突變位點(diǎn)，而且rtL180M位點(diǎn)突變常合并rtM204I/V基因位點(diǎn)突變。劉健等[12]在《拉米夫定和阿德福韋酯抗病毒療效與HBV 基因型關(guān)系》一文中對(duì)乙肝病毒耐藥基因位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果認(rèn)為， 拉米夫定組耐藥基因位點(diǎn)主要為rtL180M，其次為rtM204I/V； 阿德福韋酯組耐藥基因位點(diǎn)為rt236T，其次為rt181V/T；這與該次的研究結(jié)果不盡相同，該次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)患者出現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)以上同時(shí)突變，由于隨著抗病毒藥物應(yīng)用種類(lèi)增多和應(yīng)用范圍擴(kuò)大，乙型肝炎病毒會(huì)出現(xiàn)耐多藥基因，這對(duì)于臨床如何選擇更合適抗病毒治療方案是一種嶄新的挑戰(zhàn)。

研究中發(fā)現(xiàn)12例患者均對(duì)LAM和Ldt耐藥，3例合并ADV耐藥，5例合并ETV耐藥，這可能LAM應(yīng)用最早（1998年美國(guó)FDA第一個(gè)批準(zhǔn)的抗乙肝病毒藥物）且應(yīng)用最廣泛有關(guān)（價(jià)格相對(duì)較低），鑒于LAM耐藥率較高的原因（經(jīng)過(guò)連續(xù)5年的治療， 約70%的患者會(huì)出現(xiàn)耐藥[13]）， 替比夫定也被作為一種常用的抗病毒藥物，一旦患者出現(xiàn)LAM耐藥，對(duì)Ldt也會(huì)耐藥，如果使用Ldt治療將無(wú)效；對(duì)于LAM耐藥患者常聯(lián)合ADV用于抗病毒藥物治療以提高抗病毒藥物療效，因此使部分聯(lián)合用藥患者在LAM耐藥基礎(chǔ)上出現(xiàn)了LAM與ADV同時(shí)耐藥，近年來(lái)有學(xué)者認(rèn)為恩替卡韋能夠強(qiáng)效抑制乙肝病毒，且耐藥率低[14]，該次研究發(fā)現(xiàn)12例耐藥患者中有5例出現(xiàn)了ETV耐藥，說(shuō)明隨著ETV的推廣應(yīng)用，ETV耐藥率正在增加；因此急需研究新的耐藥率極低的抗病毒藥物以便更好地抑制乙型肝炎病毒。

研究發(fā)現(xiàn)32例陽(yáng)性患者中HBV-C型患者26例，其中突變的患者中有2例為B型，其余均為C型，由于C型基因患者多于B型基因患者，因此C患者基因耐藥突變率多于B型基因患者并不能說(shuō)明C型基因容易突變，由于樣本例數(shù)太少，尚無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-08-18）endprint