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      單寧酶水解石榴皮多酚的工藝優(yōu)化及酶解產(chǎn)物鑒定

      2018-01-23 06:21:48孫雨晴徐子偉
      關(guān)鍵詞:石榴皮單寧大孔

      孫雨晴 陶 新 徐子偉*

      (1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所,杭州 3110021;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,南京 210095)

      在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中,高密度飼養(yǎng)、斷奶應(yīng)激、熱應(yīng)激、細(xì)菌病毒感染、霉變飼料、過(guò)氧化飼料等能夠引起動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致疾病或生理異常。研究表明氧化應(yīng)激與人和動(dòng)物絕大多數(shù)應(yīng)激反應(yīng)和疾病有密切的關(guān)系。氧化應(yīng)激不僅引發(fā)動(dòng)物膿血癥、乳房炎、腸炎、肺炎和關(guān)節(jié)炎等疾病,還增加機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),減少肌肉中多不飽和脂肪酸含量,導(dǎo)致肉品質(zhì)降低[1]。通過(guò)攝入外源性抗氧化物質(zhì)有助于維護(hù)機(jī)體氧化還原狀態(tài)平衡,緩解氧化應(yīng)激,提高畜禽的健康水平和肉品質(zhì)量。

      石榴是富含抗氧化活性成分的水果,其果皮抗氧化活性成分含量尤其高[2]。有研究表明石榴皮提取物的體外抗氧化活性在1 000多種植物提取物中位列第一[3],且多酚是其發(fā)揮抗氧化作用的主要成分。除了抗氧化以外,石榴皮多酚還具有抗炎、抑菌、抗病毒、促進(jìn)傷口愈合等作用[4]。我國(guó)是石榴生產(chǎn)大國(guó),栽種面積居世界第一,年產(chǎn)量超過(guò)120萬(wàn)t[5],石榴皮作為果汁加工副產(chǎn)物產(chǎn)量巨大,石榴皮多酚資源豐富。因此,石榴皮多酚做為調(diào)控動(dòng)物健康的飼料添加劑具有非常好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。但石榴皮多酚含有大量單寧[以安石榴苷(punicalagin,PG)等鞣花單寧為主],這是一類(lèi)相對(duì)分子質(zhì)量介于500~3 000之間的多酚化合物[6],根據(jù)Lipinski等[7]的規(guī)則,它們具備氫鍵供體數(shù)目大于5、相對(duì)分子質(zhì)量大于500、氫鍵受體數(shù)目大于10的幾個(gè)特征,因而吸收或滲透性很差。大量研究也證實(shí)這些大分子單寧無(wú)法被消化道完整吸收[8-9],這限制了其體內(nèi)抗氧化活性的發(fā)揮。此外,大分子單寧還具有抗?fàn)I養(yǎng)作用,容易與蛋白質(zhì)、金屬離子形成沉淀,影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[10]。

      單寧酶是一種能水解酯鍵和縮酚羧鍵的單寧?;饷?,廣泛存在于細(xì)菌、真菌等微生物中,被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)及我國(guó)衛(wèi)生部確認(rèn)為安全的食品添加劑[11]。單寧酶可水解PG等鞣花單寧為鞣花酸(ellagic acid,EA)等小分子酚酸[12]。EA被口服后可主要經(jīng)胃吸收[13],也可以在腸道后段經(jīng)微生物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物后被腸道吸收[8],因而能在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化等生理活性。

      鑒于此,本試驗(yàn)利用單寧酶對(duì)石榴皮多酚中的大分子單寧進(jìn)行降解,探討單寧酶水解石榴皮多酚的最佳條件和酶解產(chǎn)物純化工藝,分析酶解前后石榴皮多酚在成分組成上的差異,旨在為石榴皮多酚的開(kāi)發(fā)及其在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用提供思路和指導(dǎo)。

      1 材料與方法

      1.1 主要材料、試劑和儀器

      單寧酶制劑(粉末狀),購(gòu)自湖北佳諾信生物化工有限公司;石榴皮多酚(純度為60%,粉末狀),購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司;D101大孔樹(shù)脂,購(gòu)自安徽三星樹(shù)脂科技有限公司;ADS-17大孔樹(shù)脂,購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司;SP-700大孔樹(shù)脂,購(gòu)自日本三菱化學(xué)公司;PG、EA標(biāo)準(zhǔn)品,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;色譜級(jí)甲醇、乙腈和三氟乙酸(TFA)以及其他分析純化學(xué)試劑均購(gòu)自杭州常青化工有限公司。

      Agilent 1200反相高效液相色譜(HPLC)儀,美國(guó)Life公司;UPLC-Triple TOF 5600+飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀,加拿大Sciex公司;SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Molecular公司;DSK-24電熱水浴鍋,杭州藍(lán)天儀器公司;DGG-9140BD恒溫干燥箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DL-720D超聲波清洗機(jī),上海之信儀器有限公司。

      1.2 石榴皮多酚溶液和單寧酶溶液配制

      石榴皮多酚溶液:根據(jù)要配制的濃度精確稱(chēng)量一定量的石榴皮多酚粉末加入所需的不同pH的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,超聲波處理30 min后過(guò)濾,濾液則為石榴皮多酚溶液,測(cè)定其多酚濃度。

      單寧酶溶液:稱(chēng)取單寧酶制劑粉末,按照酶∶水(質(zhì)量體積比)=1∶2的比例混合,磁力攪拌1 h,用不銹鋼過(guò)濾器過(guò)濾,再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,測(cè)定濾液中單寧酶活性,為41 U/L,1 U表示1 min內(nèi)降解1 μmol單寧酸。

      PBS的配制:配制28.4 g/L的磷酸氫二鈉溶液(即0.2 mol/L的磷酸氫二鈉),21.01 g/L的檸檬酸溶液(即0.1 mol/L的檸檬酸),然后不同體積的2種溶液混合并用pH計(jì)標(biāo)定測(cè)量,制備出不同pH的緩沖液。

      1.3 最佳酶解條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      對(duì)溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、加酶量和底物濃度(即多酚濃度)進(jìn)行單因素試驗(yàn),考察各因素對(duì)反應(yīng)液中PG降解率和EA生成率的影響。按照表1所列因素條件混合酶解反應(yīng)液使之開(kāi)始反應(yīng),結(jié)束后放入95 ℃水浴終止反應(yīng)8 min,冷卻至室溫后經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,用HPLC儀測(cè)定上清液中PG和EA含量,每個(gè)反應(yīng)條件設(shè)3個(gè)重復(fù)。

      PG降解率(%)=(1-反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液中
      PG的濃度/反應(yīng)前反應(yīng)液中PG的濃度)×100;EA生成率(%)=(反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液中
      EA的濃度/反應(yīng)前反應(yīng)液中
      EA的濃度-1)×100。

      1.4 最佳酶解條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)pH、溫度、加酶量、時(shí)間4個(gè)因素在最佳反應(yīng)條件下的水平附近設(shè)置更精細(xì)的水平變化,進(jìn)行正交組合設(shè)計(jì)。按照表2將石榴皮多酚溶液(4.00 g/L)和酶液混合、搖勻,相應(yīng)條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液放入95 ℃水浴中終止反應(yīng)8 min,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,測(cè)定上清液中PG和EA含量,每個(gè)反應(yīng)條件設(shè)3個(gè)重復(fù)。

      表1 石榴皮多酚酶解反應(yīng)的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      表2 石榴皮多酚酶解反應(yīng)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      1.5 酶解反應(yīng)液的大孔樹(shù)脂純化

      在最佳酶解條件下將石榴皮多酚與單寧酶進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾沉淀,上清液95 ℃水浴加熱8 min以滅活單寧酶,不銹鋼過(guò)濾器去除蛋白質(zhì)沉淀,將此上清液進(jìn)行純化。

      1.5.1 大孔樹(shù)脂的選擇

      根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道,選擇D101、ADS-17、SP-700這3種型號(hào)的大孔樹(shù)脂進(jìn)行比較。樹(shù)脂預(yù)處理后,采用靜態(tài)吸附和靜態(tài)洗脫方法測(cè)定3種型號(hào)的大孔樹(shù)脂對(duì)石榴皮多酚的吸附率和解吸率。

      1)靜態(tài)吸附:稱(chēng)取1 g不同型號(hào)干燥樹(shù)脂加入錐形瓶中,加入無(wú)水乙醇浸過(guò)樹(shù)脂,靜置15 min后,用水將乙醇不斷替換出,用濾紙吸干樹(shù)脂表面的水分。向錐形瓶?jī)?nèi)加入50 mL石榴皮多酚酶解液,密封,120 r/min室溫振蕩24 h。結(jié)束后測(cè)定上清液中多酚濃度,計(jì)算吸附率。

      吸附率(%)=100×(酶解液初始多酚
      濃度-酶解液平衡時(shí)多酚濃度)/
      酶解液初始多酚濃度。

      2)靜態(tài)洗脫:倒掉靜態(tài)吸附好的樹(shù)脂上清液,并用去離子水沖洗1遍,濾紙吸干表面水分,加入95%乙醇50 mL,密封,120 r/min室溫振蕩24 h,測(cè)定上清液中多酚濃度,計(jì)算解吸率。

      解吸率(%)=100×解吸液多酚濃度×解吸液
      體積/[(酶解液初始多酚濃度-
      酶解液平衡時(shí)多酚濃度)×酶解液體積]。

      1.5.2 洗脫劑濃度確定

      采用靜態(tài)洗脫方法測(cè)定乙醇濃度為50%、70%、90%、95%時(shí)的解吸率。向含有1 g飽和吸附樹(shù)脂的錐形瓶中加入50 mL不同濃度的乙醇溶液,密封后120 r/min室溫振蕩24 h,測(cè)定上清液中多酚濃度,計(jì)算解吸率。

      1.5.3 上樣體積確定

      采用濕法裝柱,將大孔樹(shù)脂裝入φ2.0 cm×30.0 cm玻璃層析柱中。石榴皮多酚酶解液以1.5 mL/min的流速上樣,流出液每50 mL收集1管,測(cè)定每管多酚濃度,繪制多酚濃度動(dòng)態(tài)曲線。

      1.5.4 洗脫體積確定

      去離子水沖洗上樣后的層析柱至流出液無(wú)色,用洗脫劑以1.5 mL/min的流速洗脫,流出液每10 mL收集1管,測(cè)定其多酚濃度。

      1.6 PG和EA含量的HPLC檢測(cè)

      色譜柱為ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫30 ℃,檢測(cè)器為紫外(UV)檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,進(jìn)樣體積為20 μL,流動(dòng)相為甲醇和0.1% TFA水溶液,流速為1.0 mL/min。線性洗脫程序?yàn)椋?~10 min,3%~14%甲醇;10~20 min,14%~40%甲醇;20~40 min,40%~100%甲醇。

      1.7 多酚含量檢測(cè)

      參考孫雨晴[16]描述的Folin-Ciocaileu法,以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合回歸方程。采用同方法測(cè)定待測(cè)樣品吸光度值,根據(jù)回歸方程計(jì)算多酚含量。

      1.8 酶解產(chǎn)物的收集

      在最佳酶解條件下將石榴皮多酚與單寧酶進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后用不銹鋼過(guò)濾器過(guò)濾,收集沉淀并烘干保存。上清液95 ℃水浴加熱8 min,不銹鋼過(guò)濾器去除蛋白質(zhì)沉淀,上清液在最佳純化條件下純化,純化所得多酚溶液80 ℃水浴蒸干。將沉淀和純化后的上清液的干物質(zhì)合并、充分研磨混勻,即所得干燥的粉末狀酶解產(chǎn)物。

      1.9 成分的液相色譜-質(zhì)譜鑒定

      準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg純化后的石榴皮多酚或其酶解產(chǎn)物粉末,溶于10 mL甲醇,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后用于液質(zhì)檢測(cè)。

      液相色譜條件:色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相A,以0.1%甲酸-乙腈為流動(dòng)相B,進(jìn)行線性梯度洗脫:0~10 min,3%~14%流動(dòng)相B;10~20 min,14%~40%流動(dòng)相B;20~43 min,40%~100%流動(dòng)相B,流速為1 mL/min;柱溫為20 ℃;紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;進(jìn)樣量10 μL。

      質(zhì)譜條件:采用負(fù)離子模式,質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍為100~1 500;霧化氣壓1(GS1) 50 psi,霧化氣壓2(GS2) 50 psi,氣簾氣壓(CUR)30 psi;離子源溫度(TEM) 550 ℃,離子源電壓(IS) 4 500 V;一級(jí)掃描去簇電壓100 V;聚焦電壓10 V;二級(jí)掃描模式為信息依賴(lài)掃描(IDA),碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量為20、40和60 V。

      1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

      單因素分析及正交試驗(yàn)部分的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析采用正交設(shè)計(jì)助手V 3.1軟件設(shè)計(jì)與分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析采用NIST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 酶解對(duì)主要多酚化合物的影響

      由HPLC指紋圖譜(圖1)的峰面積可以看出,原石榴皮多酚中含有很高比例的PG成分[包括安石榴苷a(PGa)和安石榴苷b(PGb)2個(gè)同分異構(gòu)體],而EA的比例則較低。而單寧酶和石榴皮多酚在一定條件下反應(yīng)之后,PG峰面積明顯變小,EA峰面積明顯變大,可見(jiàn)PG在單寧酶的作用下發(fā)生了水解,大量生成了EA。因此,本試驗(yàn)選用PG的降解率和EA的生成率這2個(gè)指標(biāo)來(lái)標(biāo)定酶解反應(yīng)的反應(yīng)效率和程度。

      2.2 酶解條件的單因素分析

      2.2.1 溫度對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      由圖2可以看出,在30~45 ℃之間,PG降解率和EA生成率都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),在45 ℃達(dá)到頂點(diǎn)后,繼續(xù)升溫至50 ℃則出現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì),該數(shù)據(jù)說(shuō)明該酶解反應(yīng)在45 ℃時(shí)具有最高的反應(yīng)效率。

      2.2.2 pH對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      由圖3可以看出,在pH小于5.0時(shí)PG降解率較高,超過(guò)5.0則PG降解率急劇下降。而EA生成率則隨著pH的變化而發(fā)生波動(dòng),在pH為5.0時(shí)EA生成率達(dá)到最高,低于5.0以及高于5.0都明顯降低,因此本試驗(yàn)選擇5.0為最佳反應(yīng)pH。

      2.2.3 時(shí)間對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      由圖4可以看出,PG降解率和EA生成率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。對(duì)于PG降解率而言,4~10 h表現(xiàn)為快速上升,10 h以后上升放緩,16 h以后上升曲線更加平滑。對(duì)于EA生成率而言,4~8 h上升緩慢,8~16 h呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì),16 h以后曲線基本水平,即達(dá)到平臺(tái)。綜合考慮反應(yīng)程度和效率,本試驗(yàn)選擇16 h為最佳反應(yīng)時(shí)間。

      2.2.4 加酶量對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      由圖5可以看出,當(dāng)加酶量為10~30 mL/g底物時(shí)PG降解率快速上升,大于30 mL/g底物以后趨于平緩。對(duì)于EA生成率而言,加酶量為10~20 mL/g底物時(shí)快速升高,大于20 mL/g底物以后增加緩慢,當(dāng)高于40 mL/g底物時(shí)反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)。從反應(yīng)效率以及節(jié)約酶用量2個(gè)方面綜合考慮,本試驗(yàn)選擇30 mL/g底物為最佳加酶量。

      2.2.5 底物濃度對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      由圖6可以看出,底物濃度小于1 g/L時(shí),PG降解率快速上升,這說(shuō)明相對(duì)于底物多酚,單寧酶沒(méi)有被飽和,酶的活性沒(méi)有得到充分發(fā)揮,超過(guò)1 g/L后PG降解率變化不大,基本能夠保持在95%左右。底物濃度超過(guò)2 g/L后EA生成率基本恒定,說(shuō)明在此底物濃度下EA生成效率較高。從反應(yīng)效率的角度考慮,底物濃度在0~4 g/L范圍內(nèi)越高越好。

      圖1 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜

      圖2 溫度對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      2.3 酶解條件的正交分析

      由表3可以看出,各因素影響PG降解率的順序?yàn)閜H>溫度>加酶量>時(shí)間,但這些因素對(duì)PG降解率的影響很小,在上述任意條件下,PG降解都達(dá)到95%以上,降解已經(jīng)比較徹底,因此主要考慮對(duì)EA生成率的影響。各因素對(duì)EA生成率的影響順序?yàn)閜H>時(shí)間>溫度>加酶量,且pH為3水平、溫度為2水平、加酶量為1水平、時(shí)間為3水平時(shí)是最佳反應(yīng)條件,即pH=5.2、溫度=45 ℃、加酶量=30 mL/g底物、時(shí)間=16 h為最佳反應(yīng)條件,該試驗(yàn)條件正好為正交表(表3)中的試驗(yàn)號(hào)8,該條件下的EA生成率為各組中最高,因此選用該條件為最佳酶解反應(yīng)條件。

      圖3 pH對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      圖4 時(shí)間對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      圖5 加酶量對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      圖6 底物濃度對(duì)石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

      2.4 石榴皮多酚純化工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

      2.4.1 3種型號(hào)大孔樹(shù)脂的吸附和解吸附特性比較

      由表4可以看出,D101、ADS-17、SP-700大孔

      樹(shù)脂對(duì)石榴皮多酚的吸附率都在90%左右,解吸率在95%以上,其中D101的解吸率達(dá)到99.8%,因此確定D101為終選樹(shù)脂類(lèi)型。

      表3 石榴皮多酚酶解條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

      k1、k2、k3代表結(jié)果在水平1、水平2、水平3下的平均值。R代表k1、k2、k3在各因素下的極差。

      k1, k2 and k3 stand for the mean value of the results under level 1, level 2 and level 3, respectively. R stands for the range of k1, k2 and k3 under each factor.

      表4 3種型號(hào)大孔樹(shù)脂的性能參數(shù)以及對(duì)石榴皮多酚的吸附及解吸附特性

      2.4.2 洗脫劑濃度對(duì)石榴皮多酚解吸率的影響

      由圖7可以看出,隨著乙醇濃度的提高,石榴皮多酚解吸率逐漸增加,當(dāng)洗脫劑為95%乙醇時(shí),解吸率最高,為終選洗脫劑濃度。

      2.4.3 上樣體積對(duì)吸附效果的影響

      由圖8可以看出,上樣量小于300 mL時(shí),流出液多酚濃度隨著上樣量增加快速增加;上樣量大于300 mL時(shí),流出液多酚濃度基本恒定,說(shuō)明大孔樹(shù)脂對(duì)石榴皮多酚的吸附達(dá)到飽和。因此,300 mL為本試驗(yàn)終選上樣體積。

      2.4.4 洗脫體積對(duì)洗脫效果的影響

      由圖9可以看出,隨著洗脫體積的增加,流出液多酚濃度呈現(xiàn)先增加后降低的峰形,當(dāng)洗脫體積大于120 mL時(shí),流出液多酚濃度接近0,因此確定120 mL為終選洗脫體積。

      圖7 洗脫劑濃度對(duì)石榴皮多酚解吸率的影響

      圖8 上樣體積與流出液多酚濃度的動(dòng)態(tài)曲線

      圖9 洗脫體積與流出液多酚濃度的動(dòng)態(tài)曲線

      2.5 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物中多酚含量及PG、EA含量

      經(jīng)測(cè)定,石榴皮多酚中PG含量為43.64%,EA含量為4.85%。在最佳酶解條件及最佳大孔樹(shù)脂純化條件下獲得石榴皮多酚酶解產(chǎn)物,其多酚含量為80.40%,PG未檢測(cè)到,即含量為0.00%,EA含量為45.73%。

      2.6 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物成分的質(zhì)譜分析

      石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物的紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖10,石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物質(zhì)譜總離子流圖見(jiàn)圖11。

      石榴皮多酚中鑒定出7個(gè)化合物峰:1)保留時(shí)間=15.31,m/z=1 083.061 8,PGa;2)保留時(shí)間=15.88,m/z=783.070 0,花梗鞣素(pedunculagin);3)保留時(shí)間=17.38,m/z=1 083.061 4,PGb;4)保留時(shí)間=20.92,m/z=757.090 0,特里馬素(tellimagrandin);5)保留時(shí)間=22.27,m/z=633.0737,柯里拉京(corilagin);6)保留時(shí)間=30.41,m/z=300.999 6,EA;7)保留時(shí)間=36.60,m/z=401.0879,冰島衣酸(cetraric acid)。由m/z可以看出,石榴皮多酚中化合物的相對(duì)分子質(zhì)量分布在302~1 084。

      石榴皮多酚酶解產(chǎn)物中鑒定出4個(gè)化合物峰:1)保留時(shí)間=23.14,m/z=291.015 2,短葉蘇木酚酸(brevifolin carboxylic acid);2)保留時(shí)間=25.68,m/z=600.989 5,沒(méi)食子酸(gallagic acid);3)保留時(shí)間=26.20,m/z=247.025 8,短葉蘇木酚(brevifolin);4)保留時(shí)間=30.33,m/z=300.999 5,EA。由m/z可以看出,石榴皮多酚酶解產(chǎn)物中化合物的相對(duì)分子質(zhì)量分布在248~602,與石榴皮多酚相比,小分子化合物的種類(lèi)增多,大分子化合物消失。

      3 討 論

      單寧酶廣泛存在于曲霉類(lèi)真菌微生物中,在食品工業(yè)中使用廣泛,常用于降解啤酒中的單寧,防止其與蛋白質(zhì)結(jié)合生成沉淀,使溶液澄清透明;單寧酶也用于制造速溶茶,防止發(fā)酵茶中大分子單寧相互結(jié)合發(fā)生混濁[11]。據(jù)國(guó)外已有報(bào)道,利用產(chǎn)單寧酶的黑曲霉對(duì)石榴皮進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵可獲得EA[17-18]。程艷[19]利用石榴皮單寧為誘導(dǎo)物,誘導(dǎo)黑曲霉產(chǎn)生單寧酶,提取酶后將該酶與石榴皮單寧進(jìn)行反應(yīng),用酸堿溶解法純化獲得EA。與以往單純獲得EA的研究不同,在本試驗(yàn)以PG降解率和EA生成率為目標(biāo),優(yōu)化了單寧酶水解石榴皮多酚的反應(yīng)條件和純化工藝。這樣做可以保持水解產(chǎn)物多樣性,而不是徹底生成EA單一化合物,旨在從PG水解過(guò)程中獲得更多活性化合物成分,不破壞石榴皮多酚酶解產(chǎn)物的綜合活性。

      圖10 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物的紫外吸收光譜圖

      圖11 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物質(zhì)譜總離子流圖

      本試驗(yàn)的酶解過(guò)程中,單寧酶使石榴皮多酚在化合物成分和比例上發(fā)生了變化。由酶解前后HPLC指紋圖譜可以看出,酶解前的石榴皮多酚在保留時(shí)間靠前時(shí)出峰較多且峰面積較大,而酶解后石榴皮多酚在保留時(shí)間靠后時(shí)出峰增多且峰面積較大。經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn),單寧酶水解使石榴皮多酚化合物的種類(lèi)明顯減少、相對(duì)分子質(zhì)量降低,代表性大分子化合物PG已經(jīng)被水解完全?;衔锝Y(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn),單寧酶水解主要導(dǎo)致了?;吞擒真I裂解,生成以EA為主的小分子多酚化合物。根據(jù)液相色譜的洗脫條件,結(jié)合相似相溶原理,先出峰的為極性大的水溶性物質(zhì),越往后極性越小,脂溶性也越大,本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果說(shuō)明石榴皮多酚經(jīng)酶解后極性物質(zhì)減少,脂溶性物質(zhì)增加,而脂溶性物質(zhì)的增加將有利于透過(guò)細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究了石榴皮中3種結(jié)構(gòu)單元相似、相對(duì)分子質(zhì)量不同的多酚化合物——PG(相對(duì)分子量1 084)、安石榴林(相對(duì)分子量783)、EA(相對(duì)分子量302)的體內(nèi)抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)EA對(duì)氧化魚(yú)油導(dǎo)致的小鼠氧化損傷緩解作用最強(qiáng),表現(xiàn)為緩解小鼠體重下降、提高肝臟和血液抗氧化酶活性,降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量[20]。因此,酶解PG等大分子鞣花單寧為EA等小分子酚酸,有利于石榴皮多酚在動(dòng)物體內(nèi)抗氧化活性的發(fā)揮,對(duì)石榴皮作為功能性飼料添加劑的開(kāi)發(fā)有現(xiàn)實(shí)意義。

      在本試驗(yàn)的酶解條件優(yōu)化過(guò)程中,溫度和pH對(duì)酶解反應(yīng)影響最大。隨著溫度的升高,EA生成率和PG降解率都出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),45 ℃后EA生成率比PG降解率下降更加迅速。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因在于:一方面,單寧酶具有特異性生成EA的特點(diǎn);另一方面,當(dāng)溫度升至最適溫度時(shí),EA生成率和PG降解率都升至最高,超過(guò)最適溫度后單寧酶逐漸失活,從而導(dǎo)致EA生成率驟然下降,而PG降解率隨著溫度升高可發(fā)生自身水解,即不依賴(lài)酶的作用,其產(chǎn)物也可能不以EA為主。pH變化對(duì)EA生成率和PG降解率的影響不同。在pH小于5.0條件下,PG降解率一直保持較高水平,pH等于5.0時(shí)開(kāi)始迅速下降。這種現(xiàn)象主要原因在于PG可以在酸性環(huán)境中發(fā)生自身水解,最終產(chǎn)物同樣是EA,隨著pH升高,PG自身水解效率和程度降低,還可能發(fā)生不完全水解,生成結(jié)合1分子葡萄糖的EA衍生物。當(dāng)pH為4.5時(shí),PG不完全水解明顯,EA生成率較之前降低;隨著pH繼續(xù)升高至最適酶促反應(yīng),單寧酶水解生成EA達(dá)到峰值,之后隨著PG自身水解和單寧酶作用雙重降低,導(dǎo)致EA生成率也迅速下降。由此可見(jiàn),單寧酶水解石榴皮多酚的程度不完全取決于酶促反應(yīng)過(guò)程,需要充分考慮不同反應(yīng)條件的綜合作用。本研究最終通過(guò)正交設(shè)計(jì)獲得了最佳酶解條件。

      在本研究中,為保證酶解過(guò)程pH的穩(wěn)定,加入了大量PBS,酶解產(chǎn)物無(wú)機(jī)鹽含量較高。同時(shí),PE等酶解過(guò)程有葡萄糖基脫落,產(chǎn)物中也會(huì)存在葡萄糖。為了去除酶解過(guò)程中產(chǎn)生的無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖,以多酚含量為指標(biāo),通過(guò)靜態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)選擇D101大孔樹(shù)脂,并優(yōu)化了純化工藝參數(shù)。D101型大孔樹(shù)脂是苯乙烯型非極性共聚體,對(duì)于不帶極性或弱極性的化合物具有較強(qiáng)吸附能力,適用范圍比較廣。石榴皮多酚以鞣花單寧為主,雖然鞣花單寧分子中含多個(gè)酚羥基,但其中的?;枉坊;Y(jié)構(gòu)具有一定的疏水性,適于使用非極性樹(shù)脂吸附。張立華等[21]比較了D101、AB-8、DA-201大孔樹(shù)脂對(duì)石榴皮提取物中多酚的吸附效果,發(fā)現(xiàn)D101吸附和解吸效果最好,這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

      我國(guó)是石榴生產(chǎn)大國(guó),石榴年產(chǎn)量巨大?,F(xiàn)代果汁加工業(yè)中,采用石榴全果壓榨取汁,果皮作為廢棄物資源豐富,價(jià)格低廉。石榴皮酶解技術(shù)的主要成本來(lái)自于單寧酶,為節(jié)約成本,將來(lái)要將本技術(shù)應(yīng)用于飼料領(lǐng)域,可開(kāi)展利用黑曲霉等微生物制備粗酶液水解石榴皮多酚,或者直接用產(chǎn)單寧酶微生物發(fā)酵石榴皮。從提高酶的利用率角度考慮,單寧酶固定化研究也值得開(kāi)展。

      4 結(jié) 論

      ① 本試驗(yàn)建立的單寧酶水解石榴皮多酚的最佳酶解條件為pH 5.2、溫度45 ℃、加酶量30 mL/g底物、時(shí)間16 h、底物濃度4 g/L。

      ② 酶解反應(yīng)液選擇用D101型大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化,確定95%乙醇為洗脫劑,使用φ2.0 cm×30.0 cm的玻璃層析動(dòng)態(tài)吸附時(shí),上樣體積為300 mL,洗脫體積為120 mL。

      ③ 在以上條件下獲得的石榴皮多酚酶解產(chǎn)物多酚含量為80.40%,大分子多酚化合物PE含量由酶解前的43.64%降低至0.00%,小分子多酚EA含量由酶解前的4.85%提高至45.73%,石榴皮多酚中化合物相對(duì)分子質(zhì)量分布由酶解前的302~1 084降低至248~602。

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      *Corresponding author, professor, E-mail: zjsnkyxzw@163.com

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