酸化劑和抗生素對黃羽肉雞回腸黏膜菌群的影響

容 庭 陳 莊 劉志昌 王 剛 馬現(xiàn)永 張 潔 鄧 盾

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院，廣州 510640)

動物胃腸道是一個開放且復雜的生態(tài)系統(tǒng)，每克腸道內(nèi)容物中含有1 011～1 014個微生物，且種類豐富多樣，這些微生物會對宿主的營養(yǎng)、生理及免疫產(chǎn)生顯著影響[1-2]。因此，胃腸道菌群對宿主健康的影響備受研究者的關注。飼用抗生素的不合理和不規(guī)范使用，導致動物自身免疫力下降、采食量下降及腸道菌群失調(diào)。鑒于此，功能性飼料添加劑如酸化劑、酶制劑、益生素等抗生素替代物在近20年得到廣泛的研究與應用。研究認為，酸化劑可改善畜禽的生產(chǎn)性能和腸道菌群，如提高飼糧的養(yǎng)分消化率、改善腸道微生態(tài)環(huán)境、改善小腸組織結構、促進腸道有益菌增殖、減少致病菌及細菌毒素的產(chǎn)生等[3-8]。硫酸新霉素屬于氨基糖苷類廣譜抗生素，臨床上主要用于治療畜禽細菌性胃腸道感染，口服給藥很少出現(xiàn)毒性反應，口服后大部分以原形藥隨糞便排出，畜禽體內(nèi)無藥物殘留。鑒于硫酸新霉素具有對畜禽的高度安全性以及不易產(chǎn)生耐藥性和交叉耐藥性等優(yōu)點而成為國外最常用的獸藥之一。目前，大多數(shù)研究報道均為基于酸化劑和抗生素促生長劑對畜禽腸道內(nèi)容物微生物叢的研究，而硫酸新霉素作為預防用藥和酸化劑對畜禽胃腸道黏膜微生物影響的研究尚未見報道。因此，本試驗以嶺南黃羽肉雞作為試驗素材，采用聚合酶鏈式反應(PCR)-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術與16S rDNA基因序列技術分析酸化劑和亞劑量硫酸新霉素對黃羽肉雞回腸黏膜菌群組成及多樣性的影響，為今后深入開展飼用抗生素和酸化劑的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

試驗于2014年10月29日至2014年12月9日在廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所試驗場地完成，試驗期42 d。選擇800只1日齡健康嶺南黃羽肉雞，隨機分為4個組，每組5個重復，每個重復40只雞，各組的初始體重無顯著差異(P>0.05)。對照組(A組)飼喂基礎飼糧，B、C和D組飼糧分別在基礎飼糧中添加0.2%酸化劑Ⅰ、0.3%酸化劑Ⅱ和50 mg/kg硫酸新霉素。酸化劑Ⅰ[(2009)外飼準字198號]為國外品牌，組成成分為磷酸、甲酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸和酒石酸；酸化劑Ⅱ[粵飼添字(2007)186007]為國內(nèi)品牌，組成成分為延胡索酸、乳酸、檸檬酸、丙酸和甲酸。2種酸化劑的用量均按其說明書推薦的劑量。硫酸新霉素(干品效價：675 U/mg)購于宜昌三峽制藥有限公司，其用量依據(jù)《進口獸藥質(zhì)量標準》(1999年版)。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗雞均在封閉式肉雞舍內(nèi)地面平養(yǎng)，地面鋪放木屑，光照時間24 h，自由采食和飲水。試驗選用玉米-豆粕型基礎飼糧，參照NRC(1994)建議的《雞的營養(yǎng)需要量》、《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)和《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2005年)》，按照1～21日齡和22～42日齡2個階段進行飼糧配制。1～21日齡飼糧的粗蛋白質(zhì)水平為21%，代謝能水平為12.12 MJ/kg；22～42日齡飼糧的粗蛋白質(zhì)水平為19%，代謝能水平為12.54 MJ/kg。試驗采用常規(guī)免疫程序，雞舍平均溫度約22 ℃，相對濕度控制在60%～65%。試驗期間雞只未發(fā)生疾病，采用常規(guī)消毒。

1.3 指標測定

分別于試驗雞1、21和42日齡時，以重復為單位進行空腹稱重。稱重前12 h停料、不停水，于第2天08:00進行空腹稱重。計算每個重復試驗雞的平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F(xiàn)/G)。

1.4 樣品采集、前處理及DNA提取

分別于試驗雞1、7、14、21、28、35和42日齡時，早上喂料前從每個重復中隨機挑選2只(每組10只)健康的試驗雞屠宰，采集回腸黏膜樣品(中部2 cm)，截取1 cm立即放入液氮中速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。前處理方法參照文獻[9-10]，即將樣品解凍后，將1 cm腸段縱向剪開，用滅菌生理鹽水漂洗掉大塊的內(nèi)容物，重復沖洗2次，使黏附在腸壁上的消化物和結合松懈的細菌和黏液分離；將沖洗干凈的腸段樣品放入1 mL滅菌生理鹽水(包含0.1%土溫80)中，漩渦振蕩30 s，使貼于黏膜的細菌分離，此步驟重復1次；將得到的細菌懸液13 000 r/min、4 ℃離心30 min，收集菌體。合并每組10只雞的另外1 cm回腸黏膜樣品，菌體置于1.5 mL的TE緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0)，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]中，取500 μL用來提取DNA；其余1 mL立即置于液氮中速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用EZgeneTMBacterial gDNA Kit(Biomiga，美國)試劑盒進行DNA提取，其操作步驟按說明書進行。

1.5 PCR-DGGE與圖譜分析

1.5.1 PCR-DGGE

根據(jù)參考文獻[11]設計出16S rDNA的V3區(qū)PCR擴增引物(由上海生物工程有限公司合成)，341F-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACG

GGAGGCAGCAG-3′)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。PCR反應體系(50 μL)：10×buffer(含氯化鎂)5 μL，dNTPs(10 mmol/L)4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA(20 ng/μL)5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O補足50 μL，同時設不添加模板的陰性對照；PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用1.2%的1×TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物采用試劑盒(上海生物工程有限公司)回收，其方法依照試劑盒的使用說明。

采用Bio-Rad Dcode系統(tǒng)進行PCR-DGGE凝膠電泳。凝膠梯度為40%～60%，變性方向與電泳方向一致。100%變性劑溶液含7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺。使用1×TAE緩沖液，70 V、60 ℃電泳14 h，PCR產(chǎn)物上樣量為20 μL。采用硝酸銀染色法，將銀染的凝膠放置在白光投射儀上，用數(shù)碼相機拍照并保存圖片。

1.5.2 PCR-DGGE凝膠圖像與數(shù)據(jù)分析

采用Phoretix 1D Pro (Totallab)軟件對PCR-DGGE圖像進行聚類分析。動態(tài)變化性計算公式[12]為：

% change=100-% similarity。

式中：% similarity表示2個相鄰時間點相似性的比較；% change為變化值或者改變值，表示在一段時間內(nèi)某個微生態(tài)系統(tǒng)的改變或更新程度。

1.6 16S rDNA隨機克隆文庫的構建

1.6.1 細菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴增

以42日齡黃羽肉雞回腸黏膜細菌基因組DNA為模板，根據(jù)參考文獻[11]設計出16S rDNA V3區(qū)的引物(無GC夾)進行PCR擴增。引物(由上海生物工程有限公司合成)：341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。PCR反應體系、擴增條件、電泳檢測和PCR產(chǎn)物回收同1.5.1。

1.6.2 隨機克隆文庫構建與數(shù)據(jù)分析

PCR回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體[購于寶生物工程(大連)有限公司]，置于4 ℃冰箱連接過夜，用DH5α感受態(tài)細胞[購于寶生物工程(大連)有限公司]進行重組載體轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入LB培養(yǎng)基中37 ℃、160 r/min培養(yǎng)1 h后，取適量培養(yǎng)物涂布于LB抗性平板[含50 μg/mL氨芐青霉素(Amp)、20%異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和2.5% 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)]上，將平板移置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14 h，取出置于4 ℃冰箱過夜。從平板中挑取100個白色單菌落，接入LB培養(yǎng)液(含50 μg/mL Amp)中，移入搖床170 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)12～14 h。以菌液作為模板，用引物BcaBEST Primer M13-47[購于寶生物工程(大連)有限公司]擴增pMD18-T載體目的片段，進行陽性克隆PCR鑒定，并挑選陽性克隆子的菌液進行測序(華大基因)，建立克隆文庫。文庫數(shù)據(jù)分析方法見文獻[13]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

肉雞生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)程序和Duncan氏多重比較法進行分析，數(shù)據(jù)結果以“平均值±標準誤”來表示。

測序得到的16S rDNA V3區(qū)基因序列經(jīng)DNASTAR找出目的片段，并在RDP數(shù)據(jù)庫中尋找相似性序列(相似性≥95%)進行比對分析?；啬c隨機克隆文庫中克隆子所占比例均采用u檢驗法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 嶺南黃羽肉雞的生產(chǎn)性能

由表1可知，各組各階段肉雞的終未體重、平均日增重、平均日采食量和料重比均無顯著差異(P>0.05)。由此可見，飼糧中添加酸化劑和硫酸新霉素對不同生長階段嶺南黃羽肉雞的生產(chǎn)性能無顯著影響。

表1 酸化劑與硫酸新霉素對嶺南黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響

續(xù)表1項目Items日齡DaysofageA組GroupAB組GroupBC組GroupCD組GroupD料重比F/G1～211．74±0．031．71±0．011．75±0．031．69±0．0522～422．31±0．052．33±0．492．44±0．052．35±0．011～422．14±0．022．14±0．032．21±0．032．14±0．01

同行數(shù)據(jù)肩標相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

In the same row, values with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

2.2 回腸黏膜細菌DNA提取和16S rDNA V3區(qū)PCR擴增

回腸黏膜細菌DNA電泳結果發(fā)現(xiàn)，片段大小約2 300 bp，經(jīng)核酸蛋白儀測定可作為PCR擴增16S rDNA V3區(qū)序列的模板。16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物大小約為240 bp，片段大小與預期的一致(圖略)?？寺∽覲CR鑒定結果顯示(圖1)，用引物BcaBEST Primer M13-47擴增的PCR產(chǎn)物大小約為330 bp。條帶單一無引物二聚體，片段大小正確的鑒定為陽性克隆子。4組分別從LB抗性平板上隨機挑選100個陽性克隆子，A組符合測序的克隆子總數(shù)為94個，B組為87個，C組為98個，D組為94個。

M泳道：DL 2000；1～23泳道：A、B、C及D組LB抗性平板隨機挑選的單克隆子；24泳道：陰性對照。

Lane M: DL 2000; lane 1 to 23: clones selected randomly from LB resistance plates in groups A, B, C and D; lane 24: negative control.

圖1克隆子PCR鑒定結果

Fig.1 PCR identification result of the clones

2.3 回腸黏膜菌群結構的相似性與動態(tài)變化分析

Phoretix 1D Pro軟件分析PCR-DGGE圖譜發(fā)現(xiàn)(表2)，A組與B、C、D組1～42日齡肉雞回腸黏膜菌群結構的相似性較低，分別為36%～75%、33%～75%、40%～71%。聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，A組的1日齡和B組的1日齡聚為一小類，A組的其他日齡單獨聚為一小類，且與其他各組的不同日齡均未發(fā)生聚類。動態(tài)變化趨勢分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，1～42日齡時4組肉雞回腸黏膜菌群結構發(fā)生

變化的程度不同，1～28日齡時A組的動態(tài)變化值為9%～33%，B、C、D組的動態(tài)變化值分別為8%～90%、8%～56%、17%～45%；35～42日齡時A組的動態(tài)變化值僅為11%～17%，B、C、D組的動態(tài)變化值分別為5%～67%、12%～20%和29%～33%。由此可見，飼糧中長期添加酸化劑和亞劑量硫酸新霉素導致B組肉雞1～42日齡、C和D組肉雞1～28日齡時回腸黏膜菌群結構發(fā)生劇烈變化。

表2 肉雞回腸黏膜菌群結構相似性矩陣分析

*表示同一組別相鄰2個日齡的相似性比較；#表示A組分別與其他組別同一日齡的相似性比較。

* mean comparison of the similarity in the same group at adjacent two days of age; # mean comparison of the similarity between group A and other groups at the same days of age, respectively.

A1～A42、B1～B42、C1～C42、D1～D42：A組、B組、C組、D組1、7、14、21、28、35、42日齡肉雞回腸黏膜細菌基因組DNA樣品。

A1 to A42, B1 to B42, C1 to C42 and D1 to D42: samples of genomic DNA of ileal mucosa microbiota of broilers in groups A, B, C and D at 1, 7, 14, 21, 28, 35 and 42 days of age, respectively.

圖2肉雞回腸黏膜菌群結構相似性聚類分析樹狀圖

Fig.2 The similarity clustering analysis dendrogram of ileal mucosa microbiota structure of broilers

2.4 回腸黏膜菌群多樣性分析

由表3可知，A組的庫容值低于其他3組，OTUs(operational taxonomic units)、香農(nóng)指數(shù)、均勻度、豐富度和辛普森指數(shù)均高于B和C組，A組的香農(nóng)指數(shù)和豐富度高于D組，均勻度和辛普森指數(shù)與D組相當。說明A組42日齡肉雞回腸黏膜菌群的多樣性高于B、C和D組，菌群多樣性信息豐富，物種豐富度高。

2.5 回腸黏膜細菌隨機克隆文庫分析

由表4可知，A組肉雞回腸黏膜細菌16S rDNA隨機克隆文庫有94個序列，共6個屬，歸為4個科和2個門；B組有87個序列，共3個屬，歸為3個科和1個門；C組有98個序列，共2個屬于，歸為2個科和1個門；D組有94個序列，共3個屬，歸為3個科和2個門。4組中未知序列所占克隆總數(shù)的比例分別為55.32%、86.21%、88.78%和47.87%，這些細菌在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到與其相似性為100.0%的序列(FJ471462.1)；其次是厚壁菌門(Firmicutes)，所占克隆總數(shù)的比例分別為43.62%、13.79%、11.22%和51.06%，厚壁菌門中乳桿菌科(Lactobacillaceae)所占克隆總數(shù)的比例最大，分別為39.36%、6.90%、10.20%和50.00%。A和D組乳桿菌屬(Lactobacillus)所占克隆總數(shù)的比例分別為39.36%和50.00%，極顯著高于B(6.90%)和C組(10.20%)(P<0.01)；A組與其他各組其他菌屬的種類與組成比例存在差異，且均未發(fā)現(xiàn)與埃希氏菌屬(Escherichia)相關序列。由此可見，飼糧中長期添加酸化劑和亞劑量硫酸新霉素會影響42日齡肉雞回腸黏膜細菌的種類和組成比例，尤其是優(yōu)勢菌群乳桿菌屬的比例。

圖3 肉雞回腸黏膜菌群結構動態(tài)變化趨勢圖

組別GroupsOTUs庫容Coverage香農(nóng)指數(shù)Shannonindex均勻度Evenness豐富度Richness辛普森指數(shù)SimpsonindexA組GroupA1683．0%1．420．513．300．61B組GroupB791．9%0．620．321．340．25C組GroupC594．9%0．470．290．870．21D組GroupD990．4%1．340．611．760．67

表4 42日齡肉雞回腸黏膜細菌16S rDNA隨機克隆文庫分析

續(xù)表4組別Groups門Phylum科Family屬Genus登錄號AccessionNo．相似性Similarity/%克隆數(shù)Clone克隆子所占比例Proportionofclones/%毛螺菌科Lachnospiraceae未分類毛螺菌屬UnclassifiedLachnospiraceaeS000763547S000326486S00079000197．5100．0100．01113．19(3/94)瘤胃菌科Ruminococcaceae假丁酸弧菌屬MoryellaLachnospiraceaincertaesedisclostridiumⅣS001546027100．011．06(1/94)擬桿菌門Bacteroidetes普雷沃氏菌科Prevotellaceae普氏菌屬PrevotellaS002175260100．011．06(1/94)未知序列UnknownsequenceFJ471462．199．0～100．052(3)★55．32(52/94)總計Total94B組GroupB厚壁菌門FirmicutesS000436960100．02乳桿菌科乳酸桿菌屬S000397250100．026．90LactobacillaceaeLactobacillusS000009255100．01(6/87)BS001343808100．01梭菌科Clostridiaceae未分類梭菌屬UnclassifiedClostridiaceaeS000707277100．055．75(5/87)腸球菌科Enterococcaceae腸球菌屬EnterococcusS00122066595．011．15(1/87)未知序列UnknownsequenceFJ471462．199．0～100．075(6)★86．21(75/87)總計Total87C組GroupC厚壁菌門Firmicutes乳桿菌科Lactobacillaceae乳酸桿菌屬LactobacillusS000436960S000397250S001106209100．0100．0100．072110．20(10/98)B瘤胃菌科Ruminococcaceae普拉梭桿菌屬FaecalibacteriumS00066764999．011．02(1/98)未知序列UnknownsequenceFJ471462．199．0～100．087(9)★88．78(87/98)總計Total98D組GroupD厚壁菌門Firmicutes乳桿菌科Lactobacillaceae乳酸桿菌屬LactobacillusS000397250S000436960S000859527S000352863S000330124S000859527100．0100．095．0100．0100．098．02022121150．00(47/94)A

續(xù)表4組別Groups門Phylum科Family屬Genus登錄號AccessionNo．相似性Similarity/%克隆數(shù)Clone克隆子所占比例Proportionofclones/%毛螺菌科Lachnospiraceae未分類毛螺菌屬UnclassifiedLachnospiraceaeS000013969100．011．06(1/94)放線菌門Actinobacteria微球菌科Micrococcaceae涅斯捷連科氏菌屬NesterenkoniaS000536435100．011．06(1/94)未知序列UnknownsequenceFJ471462．1100．045(6)★47．87(45/94)總計Total94

表中只列出相似性≥95%的序列。未知序列是指在RDP與GenBank數(shù)據(jù)庫中均未找到相似性≥95%的序列；★N(n)表示N個序列(其中有N-n個相同克隆子或序列，n個不同克隆子或序列)均在RDP數(shù)據(jù)庫中未找到與其相似的序列，而在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到與其相似性≥99%的序列。同列數(shù)據(jù)乳桿菌屬所占克隆總數(shù)的比例肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Sequence similarity≥95% was listed. Unknown sequence mean sequence similarity≥95% could not be found in the RDP and GenBank data base. ★N(n) meanNsequences (includedN-nidentical clones or sequences andndifferent clones or sequences) similar sequences could not be found in RDP data base, but sequences similarity≥99% could be found in GenBank data base. In the same row, values of the proportion of Lactobacillus in the total number of clones with different capital letter superscripts means significant difference(P<0.01)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05).

3 討 論

肉雞生長速度快，易受生理、環(huán)境等因素的影響造成腸道酸度不足和炎癥，而酸化劑可調(diào)節(jié)腸道適宜的酸性環(huán)境，酸化劑和抗生素均可抑制有害菌、促進有益菌增殖和消除腸道炎癥；但長期使用酸化劑和抗生素，會擾亂宿主腸道菌群的平衡。本試驗PCR-DGGE圖譜分析表明，1～42日齡時A組與B、C、D組肉雞回腸黏膜菌群結構的相似性較低，1～28日齡時B、C和D組回腸黏膜菌群結構發(fā)生劇烈變化，35～42日齡時B組回腸黏膜菌群結構發(fā)生劇烈變化。試驗期間觀察肉雞的采食、飲水、排泄等行為均表現(xiàn)正常，各組肉雞的生產(chǎn)性能無顯著差異，顯示了酸化劑與抗生素的持續(xù)壓力造成腸道內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，迫使黏膜細菌重新選擇與定植，導致黏膜菌群的多樣性相對減少，各組回腸黏膜菌屬的種類與組成比例存在差異，尤其是乳酸桿菌屬的組成比例。宿主腸道微生物叢的成熟和穩(wěn)定性受年齡、飼糧組分、抗生素、遺傳等因素的影響，進而影響宿主的生命活動[14-15]。

酸化劑在家禽生產(chǎn)中的應用研究滯后于仔豬。研究表明，飼糧中添加酸化劑能顯著降低雞十二指腸[16]、回腸[16-18]、空腸[19]和盲腸[17,19-22]內(nèi)容物中大腸桿菌的數(shù)量，但對乳酸桿菌數(shù)量影響的報道有爭議?？股氐闹饕δ苁羌膊》乐魏痛偕L，對腸道微生態(tài)影響的研究鮮有報道，且主要集中在常見抗生素促生長劑對雞腸道內(nèi)容物微生物的影響，如阿維菌素、亞甲基水楊酸桿菌肽、恩拉霉素、維吉尼亞霉素、鹽霉素等[14,23-27]。然而，抗生素促生長劑已被世界各國禁止在畜禽飼糧中添加使用或限制其最高用量，近年來關于飼用抗生素對動物腸道微生態(tài)影響的研究資料極少。本研究旨在探討酸化劑與硫酸新霉素(農(nóng)業(yè)部許可使用)對肉雞回腸黏膜菌群的影響，研究發(fā)現(xiàn)，A和D組乳桿菌屬所占克隆總數(shù)的比例分別為39.36%和50.00%，極顯著高于B(6.90%)和C組(10.20%)，這與多數(shù)有關酸化劑對雞回腸內(nèi)容物乳酸桿菌的影響結果不一致，其原因可能是酸化劑的組成種類和處理技術不同。未經(jīng)包被的酸化劑進入胃腸道后迅速發(fā)揮酸化作用，降低腸道pH，抑制大腸桿菌等有害菌的增殖，而對有益菌未發(fā)生顯著影響；酸化劑經(jīng)包被后不易被飼糧成分中和，達到緩釋效果，調(diào)節(jié)腸道pH，能顯著提高乳酸桿菌等有益菌的增殖[20,28]。各組肉雞回腸黏膜細菌16S rDNA隨機克隆文庫分析均未發(fā)現(xiàn)與埃希氏菌屬(Escherichia)相關序列，其原因可能是：1)肉雞的品種不同，腸道微生物的選擇與定植不同。報道認為，5～6周齡羅氏(ROSS)肉雞回腸黏膜中可檢測到埃希氏菌屬相關系列[29-30]，與本試驗結果不一致；2)細菌的適宜生長環(huán)境不同。大多數(shù)有害菌適宜在中性偏堿性環(huán)境中生長，如大腸桿菌pH為6.0～8.0，而有益菌更適宜于在酸性環(huán)境中生長(pH為5.4～6.4)。本試驗測得各組肉雞(42日齡)整個腸道(嗉囊至盲腸)內(nèi)容物均屬于酸性環(huán)境(pH為3.2～6.7)(數(shù)據(jù)未列出)，較適宜有益菌的生長。此外，回腸黏膜細菌16S rDNA隨機克隆文庫分析發(fā)現(xiàn)，飼糧中長期添加亞劑量硫酸新霉素能增加回腸黏膜優(yōu)勢菌群乳酸桿菌屬的組成比例，提示亞劑量抗生素作為預防用藥在畜禽生產(chǎn)上的應用將是新的研究方向，是一種積極信號，其結果目前暫未見文獻報道，有待深入研究。而有關酸化劑或抗生素、腸腔微生物和黏膜微生物3者間相互影響的研究目前尚不清楚，關于飼用抗生素與腸道黏膜菌群的相互影響需進一步研究。

4 結 論

飼糧中長期添加酸化劑和亞劑量硫酸新霉素會使1～28日齡嶺南黃羽肉雞回腸黏膜菌群結構發(fā)生劇烈變化，42日齡肉雞回腸黏膜菌群的多樣性下降，乳酸桿菌屬的組成發(fā)生改變。

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*Corresponding author, professor, E-mail: Chenzh1963@vip.sina.com