代謝工程技術(shù)方法研究進(jìn)展

楊祖明，李炳志

(1. 天津大學(xué) 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；2. 天津大學(xué) 化工學(xué)院 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072)

代謝工程是發(fā)酵菌株改造的重要技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)引入外源途徑或者改造優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)，從而將微生物改造成天然的“細(xì)胞工廠”。隨著世界能源和經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及發(fā)展面臨環(huán)境問(wèn)題的日益突出，微生物發(fā)酵作為一種綠色環(huán)保的生產(chǎn)技術(shù)，在能源、醫(yī)藥、環(huán)境等行業(yè)被廣泛應(yīng)用，在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域也取得了豐碩的成果，如：青蒿素[1]、番茄紅素[2]和1,4-丁二醇[3]等。

過(guò)去，代謝工程主要集中在通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，鑒定宿主細(xì)胞內(nèi)代謝途徑的限速步驟，確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，然后進(jìn)行基因敲除和過(guò)表達(dá)，消除限速步驟。然而，盡管這些努力在實(shí)驗(yàn)室中取得了很多成功例子，但是真正能用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的例子非常有限，主要集中在乙醇、丁醇、甘油、有機(jī)酸、氨基酸和抗生素等代謝物。近些年，合成生物學(xué)、分子生物學(xué)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展，為突破這些問(wèn)題的限制提供了可能，在代謝網(wǎng)絡(luò)分析、提高菌株性能、途徑酶的共定位表達(dá)等方面提供了新的技術(shù)和策略支撐。

1 代謝網(wǎng)絡(luò)分析

代謝工程是基于細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)研究。在對(duì)代謝途徑進(jìn)行合理地改造后,還需要對(duì)細(xì)胞整體的生理變化、代謝網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和通量進(jìn)行分析，然后提出合理可行的遺傳操作方案。目前，分析這些代謝網(wǎng)絡(luò)的方法主要有代謝通量分析( metabolic flux analysis，MFA)、代謝控制分析(metabolic control analysis，MCA)和通量平衡分析(flux balance analysis，F(xiàn)BA)(圖1)。

圖1 代謝網(wǎng)絡(luò)分析Fig.1 Analysis of metabolic pathways

1.1 代謝通量分析

在MFA中，使用穩(wěn)定的13C同位素標(biāo)記技術(shù)，在被標(biāo)記的碳源環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)代謝網(wǎng)絡(luò)中同位素分布達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)或13C-核磁共振(NMR)測(cè)量代謝物中同位素的分布，然后基于測(cè)量結(jié)果，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)主要反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量模型和細(xì)胞內(nèi)代謝物的質(zhì)量守恒來(lái)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)通量，運(yùn)用底物的攝取速率和產(chǎn)物的分泌速率計(jì)算細(xì)胞外通量。通量計(jì)算的結(jié)果最終以代謝通量路徑圖的形式展現(xiàn)出來(lái)，其中包括主要的生化反應(yīng)以及每個(gè)反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)通量。這些信息將幫助代謝工程進(jìn)行下一步的分析，確定通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞內(nèi)不尋常的通路，并估計(jì)產(chǎn)品合成的最大理論產(chǎn)量以及復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)途徑中的多個(gè)輔因子和中間體[4]。根據(jù)分析結(jié)果，從而可以選定遺傳操作的目標(biāo)，改變細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)分布，使代謝通量更多地流向目標(biāo)產(chǎn)品。如，Ghosh等[5]使用穩(wěn)定的13C同位素標(biāo)記技術(shù)測(cè)定了釀酒酵母(S.cerevisiae)中脂肪酸(fatty acid)合成路徑的碳流量分布，經(jīng)過(guò)通量分析，發(fā)現(xiàn)了其中限制脂肪酸生產(chǎn)的兩個(gè)重要因素：①由甘油-3-磷酸脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，由GPD1編碼)催化二羥丙酮磷酸(dihydroxyacetone phosphate)合成甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate)的反應(yīng)和脂肪酸的合成路徑存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。②脂肪酸合成的關(guān)鍵前體乙酰輔酶A(acetyl-CoA)會(huì)被蘋(píng)果酸合成酶(malate synthase，由MLS1編碼)催化，流向蘋(píng)果酸(malate)的合成。通過(guò)下調(diào)MLS1的表達(dá)和敲除GPD1等遺傳修飾，最終使脂肪酸的產(chǎn)量提高了70%。

1.2 代謝控制分析

由于細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)中存在許多平行反應(yīng)、代謝循環(huán)和雙向反應(yīng)，MFA并不能提供足夠準(zhǔn)確的測(cè)量， 20世紀(jì)90年代后期開(kāi)發(fā)出了很多復(fù)雜的算法，使得對(duì)細(xì)胞內(nèi)通量實(shí)現(xiàn)了更為精準(zhǔn)的測(cè)量[6-7]。這也對(duì)代謝控制分析(MCA)的發(fā)展起到了積極的作用。MCA作為傳統(tǒng)控制理論的邏輯延伸，依賴實(shí)驗(yàn)來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定代謝途徑的通量及其對(duì)系統(tǒng)擾動(dòng)的響應(yīng)變化，可以計(jì)算通路中每種酶的通量控制系數(shù)(flux control coefficient，F(xiàn)CC)表征酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝物通量的控制程度；濃度控制系數(shù)(concentration control coefficient，CCC)表征酶對(duì)給定代謝物濃度的控制程度；彈性系數(shù)(elasticity coefficient，EC)表征酶響應(yīng)于擾動(dòng)(例如底物濃度、抑制劑濃度)的能力。 FCC和CCC是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的特性，而EC是特定酶的函數(shù)。綜合而言，這些信息可用于梳理代謝網(wǎng)絡(luò)的控制結(jié)構(gòu)，闡明酶活性的相對(duì)變化如何影響通路流量，可以幫助指導(dǎo)分子生物學(xué)技術(shù)的合理應(yīng)用，將更多的通量轉(zhuǎn)移到目標(biāo)產(chǎn)品。例如，在線性代謝途徑中，如果一種酶的FCC值較高，那么它就可以被認(rèn)定是速率限制的主要因素。因此，將其過(guò)表達(dá)可以使該途徑的通量增加。Cintolesi等[8]將MCA方法用于對(duì)大腸桿菌(E.coli)的甘油發(fā)酵進(jìn)行代謝定量分析，利用計(jì)算的通量控制系數(shù)(FCC)預(yù)測(cè)甘油發(fā)酵過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖酵解通量是由甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase,由gldA編碼)和二羥基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase,由dhaKLM編碼)控制。通過(guò)遺傳操作，使gldA和dhaKLM過(guò)表達(dá)，結(jié)果與MCA分析一致，甘油利用率和乙醇產(chǎn)量顯著增加[9]。

1.3 通量平衡分析

微生物全基因組序列的測(cè)定以及基因功能注釋工具的開(kāi)發(fā)極大地促進(jìn)了基因組水平代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建,提高了代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的分析能力。通量平衡分析(FBA)是一種通過(guò)構(gòu)建基因組水平代謝網(wǎng)絡(luò)模型(genome-scale metabolic model，GEM)，從系統(tǒng)水平上認(rèn)識(shí)微生物的復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)，模擬預(yù)測(cè)環(huán)境擾動(dòng)或遺傳改組后細(xì)胞的代謝響應(yīng)，篩選出基因敲除和過(guò)表達(dá)的最佳組合，以增加生物體生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的能力[10]。隨著新組學(xué)數(shù)據(jù)的開(kāi)發(fā)和基因組注釋方法的改進(jìn)，還可以在代謝網(wǎng)絡(luò)模型中引入相關(guān)的反應(yīng)監(jiān)管調(diào)控機(jī)制[11]對(duì)模型進(jìn)行不斷改進(jìn)。近些年，研究人員針對(duì)大腸桿菌開(kāi)發(fā)了一種非常全面的GEM模型，包括2 077個(gè)反應(yīng)和1 039個(gè)代謝物[12]。這些模型在實(shí)際中具有相當(dāng)多的用途，例如，研究人員在該模型的基礎(chǔ)上，運(yùn)用通量平衡分析的方法確定了一株高產(chǎn)番茄紅素菌株的基因敲除目標(biāo)，最終使其產(chǎn)量相對(duì)于親本菌株增加了37%[13]。與此同時(shí)，研究人員也開(kāi)發(fā)了很多計(jì)算程序，被用來(lái)自動(dòng)計(jì)算基因優(yōu)化策略[14]。例如，Optknock程序[14-15]通過(guò)解決雙層優(yōu)化問(wèn)題，內(nèi)部?jī)?yōu)化生物量和外部?jī)?yōu)化目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)量，利用二元理論搜索多個(gè)基因敲除候選者；OptGene可用于優(yōu)化非線性目標(biāo)函數(shù)[16]，其算法可以迅速鑒定出菌株的基因缺失組合；RobustKnock[17]用來(lái)識(shí)別與主要代謝路徑存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的途徑。

2 逆向代謝工程策略

大多數(shù)代謝工程最初的努力主要集中于以上幾種經(jīng)典的代謝工程分析方法，通過(guò)通量測(cè)定和代謝途徑分析，確定動(dòng)力學(xué)瓶頸，然后理性分析設(shè)計(jì)，合理地操縱新陳代謝將通量轉(zhuǎn)向目標(biāo)產(chǎn)品。但是通常菌株的表現(xiàn)型和基因的聯(lián)系非常復(fù)雜，通過(guò)理性分析設(shè)計(jì)的方法很難獲得工業(yè)生產(chǎn)的菌株表型。這種情況下，可以使用逆向代謝工程策略，與理性代謝工程不同，它不一定依賴于代謝途徑分析的先驗(yàn)知識(shí)。而是運(yùn)用各種突變技術(shù)對(duì)菌株的基因組進(jìn)行隨機(jī)突變，再高通量篩選突變體，以獲得優(yōu)良的表現(xiàn)型，然后利用高通量基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)野生型菌株和突變菌株的基因組序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，獲得突變信息，再通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等相關(guān)組學(xué)技術(shù)，鑒定其中發(fā)生的有利突變，最后，將有利突變引入野生菌株中，剔除不利突變，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)操作，最終獲得只含有利突變的菌株[18](圖2)。逆向代謝工程成功的關(guān)鍵在于突變文庫(kù)的遺傳多樣性和突變的質(zhì)量水平，下面回顧最近的一些組合技術(shù)方法在逆向代謝工程中的發(fā)展應(yīng)用[19]。

圖2 逆向代謝工程策略Fig.2 Inverse metabolic engineering

2.1 定向馴化

在特定的生長(zhǎng)條件下，使菌株自發(fā)地發(fā)生突變以提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力是經(jīng)典的定向馴化方法。這種方法在工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中被廣泛運(yùn)用，產(chǎn)生了許多成功的例子，包括增加菌株對(duì)乙醇和異丁醇的耐受性[20-21]、提高釀酒酵母對(duì)木糖和半乳糖的利用[22-23]以及利用大腸桿菌生產(chǎn)D-乳酸(D-lactate)[24]等。

2.2 轉(zhuǎn)座子誘變

這種類型的誘變可以使轉(zhuǎn)座元件在整個(gè)基因組中隨機(jī)插入，同時(shí)使插入的基因序列發(fā)生功能性破壞。轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)在天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)中十一烷基多糖苷的生產(chǎn)[25]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中核黃素的生產(chǎn)[26]以及釀酒酵母中類異戊二烯[27]的生產(chǎn)中都起到了積極的促進(jìn)作用。

2.3 細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制工程(global transcription machinery engineering，gTME)

細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)具有高度的復(fù)雜性，菌株的某些特定表型往往由多個(gè)基因共同控制，過(guò)去主要通過(guò)敲除和過(guò)表達(dá)對(duì)其中一個(gè)或幾個(gè)基因進(jìn)行修飾，但是往往得不到理想的適用于工業(yè)生產(chǎn)菌株。隨著對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程認(rèn)識(shí)的深入，人們開(kāi)始直接操控轉(zhuǎn)錄組來(lái)控制整個(gè)細(xì)胞內(nèi)各種基因的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶能夠?qū)D(zhuǎn)錄行使全局調(diào)控功能，因此突變RNA聚合酶可以使多種基因控制的菌株表型得到優(yōu)化。在RNA聚合酶參與轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，σ等各種轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的識(shí)別、激活和控制[28]，運(yùn)用全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控技術(shù)對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行適當(dāng)?shù)匦揎?，能夠使整個(gè)基因組的轉(zhuǎn)錄發(fā)生全局性改變。Alper 等[29]利用全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控技術(shù)，將大腸桿菌中編碼σ70因子的rpoD基因用易錯(cuò)PCR進(jìn)行突變，獲得了一個(gè)rpoD基因突變文庫(kù)，并將突變后的rpoD基因引入野生型大腸桿菌，使得大腸桿菌對(duì)乙醇的耐受能力大幅度提高。

2.4 鋅指結(jié)構(gòu)突變

鋅指結(jié)構(gòu)是鋅指蛋白中高度特異的DNA 結(jié)合域,能識(shí)別3個(gè)堿基序列，在細(xì)胞內(nèi)的多種調(diào)節(jié)蛋白里都發(fā)現(xiàn)了鋅指結(jié)構(gòu)[30-31]。 Park等[32]對(duì)多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)進(jìn)行突變,構(gòu)建了人工的鋅指文庫(kù),并引入酵母,得到了對(duì)滲透脅迫作用和真菌藥物咪康唑(ketoconazole) 抗性提高的酵母突變體。此外,由于鋅指蛋白能夠特異性結(jié)合DNA序列，研究人員構(gòu)建生成了結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活或抑制功能區(qū)的人工轉(zhuǎn)錄因子文庫(kù)，并在提高動(dòng)物細(xì)胞和釀酒酵母生產(chǎn)重組蛋白效率的研究中取得了成功的應(yīng)用[33]。

2.5 核糖體工程

將微生物細(xì)胞暴露在抑制核糖體功能的致死濃度抗生素里，例如氯霉素、利福平、鏈霉素或卡那霉素，并且篩選對(duì)這些抗生素在不同水平上有抗性的突變體。通常對(duì)這些抗生素的抗性來(lái)自核糖體組成部分的突變，比如核糖體蛋白和RNA。這些變化可導(dǎo)致異常的蛋白質(zhì)合成和提高特殊蛋白的生產(chǎn)。Tanaka及其同事[34]的研究表明，在編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因上引起突變，導(dǎo)致丁酸梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)對(duì)鏈霉素(streptomycin)的抗性提高，此外還突變了與丁醇合成相關(guān)的基因，最終使丁醇產(chǎn)量增加了1.6倍，達(dá)到16.5 g/L，結(jié)果分析顯示，在抗性增加的突變體中，參與丁醇合成的丁醛脫氫酶(AdhE)和丁醇脫氫酶(BdhAB)的活性都顯著增加。

3 代謝途徑酶的共定位表達(dá)

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，代謝工程不再過(guò)度集中于通過(guò)過(guò)表達(dá)或敲除特定基因以調(diào)節(jié)代謝通量的走向，一些更加精細(xì)的調(diào)節(jié)方法正在開(kāi)發(fā)中。其中，優(yōu)化多步代謝途徑中關(guān)鍵酶的空間分布的方法被廣泛應(yīng)用，這些方法包括：構(gòu)建融合蛋白、蛋白質(zhì)支架組裝、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位(圖3)。通過(guò)優(yōu)化酶的空間分布，可以提高蛋白和底物之間的相互作用，減少中間體流入競(jìng)爭(zhēng)路徑，減少細(xì)胞內(nèi)噪聲干擾并提供適宜的催化環(huán)境。

3.1 構(gòu)建融合蛋白

構(gòu)建融合蛋白是目前最簡(jiǎn)單并且被廣泛運(yùn)用的共定位方法，通過(guò)將兩個(gè)或多個(gè)基因與接頭序列融合產(chǎn)生一個(gè)具有多功能的融合蛋白。接頭區(qū)使各個(gè)蛋白在空間上相互靠近，同時(shí)又能使結(jié)構(gòu)域分離，減少了蛋白之間的相互折疊干擾，使各個(gè)蛋白保持其天然活性[35-36]。Zhang等[37]將合成路徑中的4-香豆酰基-乙酰連接酶(4-coumaroyl-CoA ligase)和二苯乙烯合酶(stilbene synthase)用一個(gè)三氨基酸序列連接起來(lái)，使白藜蘆醇的產(chǎn)量比原來(lái)提高了15倍。隨后的動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)研究證實(shí)，產(chǎn)量的提高是由于酶活性位點(diǎn)的接近而不是來(lái)自任何酶的催化活性的提高[38]，這也說(shuō)明了融合蛋白克服了中間體擴(kuò)散的限制，進(jìn)而提高了產(chǎn)物濃度和產(chǎn)量。

3.2 蛋白質(zhì)支架組裝

將路徑酶連接到支架的方法在代謝工程領(lǐng)域也產(chǎn)生了非常好的效果，雖然這個(gè)方法比較復(fù)雜，但是相對(duì)于融合蛋白更具優(yōu)點(diǎn)，如可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)支架結(jié)構(gòu)和改變結(jié)合酶數(shù)量。支架的空間架構(gòu)是路徑優(yōu)化的關(guān)鍵，因?yàn)橹Ъ艿臉?gòu)型和比例對(duì)于平衡反應(yīng)通量以提高目標(biāo)產(chǎn)品產(chǎn)率是至關(guān)重要的。蛋白質(zhì)支架在甲羥戊酸途徑中取得了非常好的效果，在最佳的支架結(jié)構(gòu)下，甲羥戊酸(mevalonate)途徑通量提高了77倍[39]。麻省理工學(xué)院的Prather實(shí)驗(yàn)室也運(yùn)用同樣的策略共定位葡糖二酸途徑的3個(gè)酶，盡管從相當(dāng)高的質(zhì)量濃度(約0.5 g/L)開(kāi)始，但是最后通過(guò)蛋白質(zhì)支架組裝技術(shù)將葡糖二酸的濃度提高了5倍[39-40]。與融合蛋白一樣，蛋白質(zhì)支架不僅能催化連續(xù)的途徑步驟，而且還能夠增加蛋白質(zhì)之間的相互作用的速率[41]。另外，支架蛋白也可以被工程化以產(chǎn)生新的信號(hào)傳導(dǎo)途徑以產(chǎn)生新的表型，如工程化MAP激酶(MAP kinase)途徑的研究[42]。

3.3 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

將代謝途徑酶共定位到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)是最為復(fù)雜的空間定位方法。這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間大于支架蛋白，能夠容納大量蛋白質(zhì)，并且能夠更好地限制物質(zhì)跨越邊界進(jìn)行傳遞。因此，這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以整合中間體以防止對(duì)細(xì)胞的毒性作用，并且能夠限制競(jìng)爭(zhēng)路徑以及增加底物、酶和輔因子的局部濃度以提高產(chǎn)率。

在真核宿主中，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有不同于細(xì)胞質(zhì)的pH、氧化還原電位、輔因子和代謝物組成，這些條件可能對(duì)酶促反應(yīng)熱力學(xué)更有利，幫助宿主實(shí)現(xiàn)更高的催化效率。Avalos等[43]將酵母中生產(chǎn)異丁醇的下游路徑由細(xì)胞質(zhì)全部定位到線粒體，由于中間體利用度和酶濃度增加，并且限制了競(jìng)爭(zhēng)路徑，使得異丁醇的產(chǎn)量提高了260%。目前，涉及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位主要使用N末端靶向序列進(jìn)行蛋白質(zhì)靶向的方法，通常被靶向的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有過(guò)氧化物酶體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等。表1列舉了近年來(lái)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位方面取得的一些成果。

圖3 酶的共定位表達(dá)技術(shù)Fig.3 Enzyme co-localization technology

表1 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位研究匯總

4 代謝工程與合成生物學(xué)

合成生物學(xué)，即生物學(xué)的工程化，通過(guò)采用工程化的設(shè)計(jì)思路，借助計(jì)算機(jī)科學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)等學(xué)科的相關(guān)理論，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的基因元件和模塊，然后根據(jù)設(shè)計(jì)的需要，采用“自下而上”的策略，組裝合成新的基因電路、生物模塊、細(xì)胞乃至生命體。隨著合成生物學(xué)的核心技術(shù)人工合成基因組的進(jìn)步以及人工模塊庫(kù)的不斷豐富，合成生物學(xué)為代謝工程提供了許多新的方法策略(圖4)，相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)方法，合成生物學(xué)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在：①模塊的標(biāo)準(zhǔn)化和計(jì)算方法的發(fā)展進(jìn)步，不僅節(jié)省了時(shí)間、人力，還提高了代謝路徑組裝設(shè)計(jì)的可預(yù)測(cè)性和可靠性。②合成生物學(xué)拓展了人工改造的尺度，可以利用不同物種來(lái)源的基因元件和生物模塊設(shè)計(jì)及組合來(lái)合成非天然分子。③優(yōu)化改造宿主，改變內(nèi)部環(huán)境，提高路徑和宿主的適配性。④基因電路的發(fā)展為響應(yīng)發(fā)酵環(huán)境變化，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的調(diào)控提供了可能。

圖4 代謝工程與合成生物學(xué)Fig.4 Metabolic engineering and synthetic biology

4.1 宿主細(xì)胞的改造和開(kāi)發(fā)

宿主細(xì)胞是代謝途徑正常發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，不僅能夠保留復(fù)制生物裝置的遺傳信息，而且能夠?yàn)樯镅b置的運(yùn)行提供能量、還原力、各種因子和基礎(chǔ)物質(zhì)。過(guò)去代謝工程的研究主要集中在實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)模式生物——釀酒酵母或者大腸桿菌中，主要是由于它們的生理學(xué)、遺傳學(xué)背景已經(jīng)了解得非常透徹，全基因組已經(jīng)完成測(cè)序而且開(kāi)發(fā)了很多成熟的分子生物學(xué)工具。然而，將許多非常有應(yīng)用前景的異源生物代謝途徑組裝到釀酒酵母或者大腸桿菌中，運(yùn)行的結(jié)果并不理想，而且由于未來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)條件的限制，如高溫、苛刻的酸性或堿性等條件，需要對(duì)目前的宿主底盤(pán)細(xì)胞進(jìn)行改造，使其和代謝模塊適配。目前，利用合成生物學(xué)的方法改造宿主細(xì)胞主要有兩種策略:人工合成最小基因組(minimal genome)和人工全基因組合成[54]。最小基因組既能夠?yàn)樗拗骷?xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖提供必要的分子機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)，又降低了細(xì)胞內(nèi)不必要的代謝途徑、反饋調(diào)控路徑的影響,簡(jiǎn)化了宿主細(xì)胞的遺傳背景,提高代謝效率。Pósfai等[55]通過(guò)基因序列比對(duì),刪除了大腸桿菌基因組中引起 DNA結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的 DNA 片段和非必需功能的基因，將E.coliMG1655菌株的基因組減少了15.27%，最后得到了在豐富培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度沒(méi)有明顯降低的菌株，這一研究成果充分說(shuō)明了在宿主細(xì)胞中構(gòu)建最小基因組的可行性。近些年，由于DNA合成技術(shù)的發(fā)展和物種基因組信息不斷豐富，大大促進(jìn)了從全基因組水平上對(duì)宿主細(xì)胞遺傳改造的進(jìn)程。最近中美英等國(guó)科學(xué)家聯(lián)合參與的人工合成釀酒酵母基因組Sc2.0計(jì)劃順利完成，標(biāo)志著人類實(shí)現(xiàn)了從讀取生命信息到編碼生命信息的里程碑式的跨越，也意味著人類向化學(xué)物質(zhì)合成生命邁出了一大步。對(duì)釀酒酵母基因組的合成并不只是簡(jiǎn)單地復(fù)制，在保證菌株在各種環(huán)境條件下正常生長(zhǎng)的同時(shí)，加入了大量的特異性重組位點(diǎn)和特異性識(shí)別標(biāo)簽，使基因組具有更好的靈活性和可操作性[56]，為后續(xù)開(kāi)展遺傳操作改良菌株提供了基礎(chǔ)。

4.2 非天然化學(xué)品的生物合成

有別于傳統(tǒng)代謝工程，利用合成生物學(xué)技術(shù)合成非天然化學(xué)品有著很多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①合成生物學(xué)技術(shù)可以將不同物種來(lái)源的基因元件和生物模塊進(jìn)行設(shè)計(jì)組裝，構(gòu)建非天然分子合成路徑。②利用合成生物學(xué)的基因組裝技術(shù)可以快速將大片段 DNA 組裝成完整的代謝通路。③可以根據(jù)天然酶反應(yīng)和化學(xué)逆合成分析方法從頭設(shè)計(jì)構(gòu)建自然界中不存在的代謝途徑。Hanai 等[57]通過(guò)跨種屬組合表達(dá)來(lái)自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)乙酰乙酸脫羧酶基因adc和乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因thl、來(lái)自拜氏羧菌(Clostridiumbeijerinckii)的乙醇脫氫酶基因adh和來(lái)自大腸桿菌的乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因atoAD，在大腸桿菌內(nèi)首次構(gòu)建了合成異丙醇的代謝途徑，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵培養(yǎng)30.5 h，異丙醇產(chǎn)量達(dá)到了81.6 mmol/L。

如果目標(biāo)產(chǎn)物的代謝途徑未知,就需要采用從頭合成代謝途徑(de novo biosynthetic pathways)的方法。Yim等[58]使用這種方法在大腸桿菌體內(nèi)構(gòu)建了1,4-丁二醇的代謝路徑。首先他們通過(guò)檢查功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)化，用計(jì)算機(jī)搜索了超過(guò)10 000條合成路徑，然后建立諸如熱力學(xué)可行性、最大理論產(chǎn)量、路徑長(zhǎng)度等標(biāo)準(zhǔn)排查篩選，最終建立了由5個(gè)異源酶催化合成目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成路徑，然后經(jīng)過(guò)后期改造優(yōu)化，最終1,4-丁二醇的產(chǎn)量達(dá)到了18 g/L。

4.3 代謝工程的精準(zhǔn)調(diào)控

迄今為止，在代謝工程的大多數(shù)應(yīng)用中，異源途徑的表達(dá)通常使用靜態(tài)調(diào)節(jié)策略。在計(jì)算和實(shí)驗(yàn)工具的幫助下，通過(guò)使用基因敲除、啟動(dòng)子替換和異源基因的引入在細(xì)胞中改變靜態(tài)通量分布方面非常成功。然而，在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，隨著細(xì)胞周圍生長(zhǎng)環(huán)境的變化，如底物濃度、溶氧量、細(xì)胞密度等，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率會(huì)明顯降低，導(dǎo)致生產(chǎn)目標(biāo)化合物的能力受限于細(xì)胞生物量的減少。因此，為了實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的高產(chǎn)，需要在宿主代謝過(guò)程中引入動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的變化，重新平衡代謝通量的分布。Zhang等[59]設(shè)計(jì)了一種動(dòng)態(tài)響應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)(dynamic sensor-regulator system，DSRS)來(lái)調(diào)控大腸桿菌中脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl ester，F(xiàn)AEE)的生產(chǎn)。在該代謝通路中，平衡脂肪酸乙酯合成路徑中關(guān)鍵中間體脂肪?；o酶A(fatty acyl-CoA)和乙醇對(duì)于提高脂肪酸乙酯的生產(chǎn)是至關(guān)重要的，因?yàn)橹觉；o酶A的過(guò)高積累不僅會(huì)和細(xì)胞內(nèi)生物膜的合成路徑爭(zhēng)奪脂肪酸(fatty acid)，還需要消耗過(guò)多的乙酰輔酶A(acetyl-CoA)，同時(shí)乙醇水平過(guò)高還會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生不利的影響，見(jiàn)圖5。由圖5可知：該系統(tǒng)的調(diào)控作用主要是基于一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FadR，它能夠感應(yīng)大腸桿菌中脂肪酸乙酯代謝通路中脂肪酸的水平，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸濃度較低時(shí)，F(xiàn)adR會(huì)對(duì)P1、P2和P3啟動(dòng)子起抑制作用，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)脂肪?；o酶A和乙醇的濃度，抑制脂肪酸乙酯的合成。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸濃度較高時(shí)，首先脂肪酸會(huì)在?；o酶A合成酶(acyl-CoA synthase，ACS)的作用下轉(zhuǎn)化成脂肪?；o酶A，然后脂肪?；o酶A會(huì)和FadR結(jié)合形成FadR-FA復(fù)合體，解除FadR對(duì)P1 、P2和P3啟動(dòng)子的抑制，提高了細(xì)胞內(nèi)脂肪酰基輔酶A和乙醇的濃度，促進(jìn)了脂肪酸乙酯的合成。最終在DSRS系統(tǒng)的調(diào)控下，脂肪酸乙酯的產(chǎn)量達(dá)到了1.5 g/L，產(chǎn)率提高了3倍。

生物傳感器用于動(dòng)態(tài)控制的一些例子已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)。然而，到目前為止，其中許多需要耗費(fèi)大量時(shí)間篩選適當(dāng)?shù)纳飩鞲衅骱屯ㄟ^(guò)啟動(dòng)子工程平衡基因表達(dá)。合成和系統(tǒng)生物學(xué)新工具的快速發(fā)展將有助于擴(kuò)大動(dòng)態(tài)代謝工程領(lǐng)域，并簡(jiǎn)化實(shí)施所需的過(guò)程。通過(guò)組合雙穩(wěn)態(tài)開(kāi)關(guān)[60]、生物振蕩器[61]、生物放大器[62]以及能夠執(zhí)行邏輯功能的AND、OR和NOR門(mén)等基因元件，可以構(gòu)建傳導(dǎo)復(fù)雜生物信號(hào)的基因線路[63]，來(lái)響應(yīng)細(xì)胞發(fā)酵環(huán)境的變化，進(jìn)而更精準(zhǔn)地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)通量的流向。

PDC—pyruvate decarboxylase(edcoded by pdc)；ADH—alcohol dehydrogenase (encoded by adhB )；ACS—acyl-CoA synthase(edcoded by fadD )；WES—wax-ester synthase(encoded by atfA)；FAS—fatty acid synthase 圖5 脂肪酸乙酯合成路徑動(dòng)態(tài)響應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)Fig.5 Dynamic sensor-regulator system of fatty acid ethyl ester synthesis path

4.4 模塊化工程

優(yōu)化和平衡多基因調(diào)控的代謝途徑通常是低效的，往往一個(gè)限制性步驟剛解決，新的代謝瓶頸又會(huì)出現(xiàn)，需要經(jīng)過(guò)多輪的設(shè)計(jì)、優(yōu)化，非常耗時(shí)。為了解決上述問(wèn)題，模塊化代謝路徑已經(jīng)發(fā)展成為一種有希望的策略[64]，可以將代謝途徑劃分成若干個(gè)模塊，然后利用調(diào)控元件組裝不同活性模塊，最后通過(guò)調(diào)整模塊間的相對(duì)活性，得到代謝模塊相對(duì)活性平衡的最佳重組菌株[65]。根據(jù)模塊化工程采用策略的差異，可將其分為三種不同的類型：①基于代謝網(wǎng)絡(luò)中生化反應(yīng)的模塊化。根據(jù)生化反應(yīng)產(chǎn)物的濃度、毒性大小等生化特性劃分模塊，通過(guò)平衡不同模塊的相對(duì)強(qiáng)度，減少了中間代謝物的積累對(duì)菌體產(chǎn)生的毒害作用和其他競(jìng)爭(zhēng)路徑的干擾[66]。②基于代謝網(wǎng)絡(luò)分支點(diǎn)的模塊化。以代謝網(wǎng)絡(luò)分支點(diǎn)為基礎(chǔ)，將分支點(diǎn)處的中心代謝路徑和其他分支路徑模塊化，通過(guò)微調(diào)中心代謝路徑和分支路徑的通量比，實(shí)現(xiàn)了菌株生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)品合成的協(xié)同[67]。③基于酶促反應(yīng)效率的模塊化[68]。根據(jù)酶促反應(yīng)效率的不同，將代謝網(wǎng)絡(luò)中的酶促反應(yīng)劃分為不同的模塊，通過(guò)優(yōu)化不同模塊的催化效率，提高中間體的催化效率和轉(zhuǎn)運(yùn)效率。 Liu等[69]利用模塊化工程技術(shù)優(yōu)化了枯草芽孢桿菌中的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的路徑，將枯草芽孢桿菌胞內(nèi)代謝途徑分為 3 個(gè)模塊，最后將活性強(qiáng)度不同的 3 個(gè)模塊進(jìn)行拼裝組合，篩選出活性相對(duì)平衡的最佳重組菌，成功地將N-乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)量提高了4.3 倍，達(dá)到 2.0 g/g。

4.5 無(wú)細(xì)胞代謝工程

雖然通過(guò)代謝工程途徑異源表達(dá)化學(xué)物質(zhì)成功的案例正在不斷增長(zhǎng)，但是真正可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)的化學(xué)品卻非常有限。這主要是由于細(xì)胞本身所固有的局限性，主要體現(xiàn)在:①細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，使得合理設(shè)計(jì)難以預(yù)測(cè)，平衡網(wǎng)絡(luò)中的代謝通量需要大量的分析和實(shí)驗(yàn)，但是產(chǎn)量提升效果很有限。②目標(biāo)產(chǎn)物或中間體的積累對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，而且存在很多競(jìng)爭(zhēng)途徑和抑制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也大大限制了代謝產(chǎn)量。③細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)在不同細(xì)胞器之間的跨膜運(yùn)輸障礙降低了目標(biāo)產(chǎn)品的合成效率。④工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)對(duì)發(fā)酵條件的控制提出了嚴(yán)苛的要求，往往很難達(dá)到和實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模生物合成相同的條件，而且代謝產(chǎn)生了很多副產(chǎn)物，不利于下游分離。近些年，無(wú)細(xì)胞代謝工程(cell-free metabolic engineering,CFME)的發(fā)展正在克服這些限制，提供替代的解決方案，擴(kuò)大了傳統(tǒng)代謝工程的應(yīng)用范圍。通過(guò)體外組合由純化酶或細(xì)胞粗裂解物制備的催化蛋白質(zhì)來(lái)生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物。相對(duì)于體內(nèi)系統(tǒng)，無(wú)細(xì)胞代謝工程能夠通過(guò)分子“設(shè)計(jì)—建造—測(cè)試”平臺(tái)而非重新設(shè)計(jì)構(gòu)建生命裝置元件，實(shí)現(xiàn)合成路徑的快速調(diào)試和優(yōu)化，其前所未有的控制和設(shè)計(jì)自由度推動(dòng)了這一領(lǐng)域的快速發(fā)展。Korman等[70]設(shè)計(jì)了一個(gè)由27個(gè)酶組成的無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)，通過(guò)改變萜烯合酶，能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為不同的單萜，一次添加葡萄糖能使系統(tǒng)連續(xù)穩(wěn)定工作至少5 d，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，使葡萄的轉(zhuǎn)化率大于95%，單萜產(chǎn)量超過(guò)了15 g/L，比傳統(tǒng)微生物發(fā)酵的產(chǎn)量高出了一個(gè)數(shù)量級(jí)，凸顯了CFME系統(tǒng)合成天然產(chǎn)品的巨大潛力。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

代謝工程發(fā)展20多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)代謝工程的研究主要集中在代謝網(wǎng)絡(luò)的分析評(píng)估和優(yōu)化控制兩個(gè)領(lǐng)域。在分析評(píng)估方面，研究人員基于不同的策略并運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)開(kāi)發(fā)了很多分析評(píng)估方法，為代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化控制提供了基礎(chǔ)。代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化控制是提高代謝效率和產(chǎn)量的關(guān)鍵。該技術(shù)的發(fā)展主要集中在以下三個(gè)方面：

1)逆向代謝工程。隨著高通量基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，能夠低成本地對(duì)野生型菌株和突變菌株的基因組序列進(jìn)行快速比對(duì)，獲得突變信息，再通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等相關(guān)組學(xué)技術(shù)鑒定其中的有利突變并將其引入菌株。但是運(yùn)用組合技術(shù)方法突變會(huì)產(chǎn)生巨大的突變文庫(kù)，給篩選帶來(lái)了壓力，需要針對(duì)特定菌株和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)出適合的高通量篩選技術(shù)。

2)酶工程策略。過(guò)去酶工程策略主要集中在改變酶的活性和特異性等方面，最近三維超高分辨率顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步推動(dòng)了途徑酶共定位表達(dá)技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)優(yōu)化酶在細(xì)胞內(nèi)的空間分布，減少了中間體流失，提高了底物和酶濃度，使代謝網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行效率大幅提高。

3)合成生物學(xué)與代謝工程。合成生物學(xué)技術(shù)為代謝工程的模塊化、精準(zhǔn)化提供了有力支撐，能夠通過(guò)不同模塊間的適配和生物傳感器的響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)代謝網(wǎng)絡(luò)中的通量平衡和實(shí)時(shí)調(diào)控。

另外，合成生物學(xué)技術(shù)在改造底盤(pán)細(xì)胞，減少細(xì)胞噪聲干擾，提高代謝路徑和底盤(pán)細(xì)胞的適配性方面也發(fā)揮了積極的作用。但是由于細(xì)胞自身代謝網(wǎng)絡(luò)的高度復(fù)雜性，未來(lái)研究人員不僅需要在基礎(chǔ)領(lǐng)域進(jìn)一步加深對(duì)生命的認(rèn)識(shí)，還可以通過(guò)無(wú)細(xì)胞合成技術(shù)來(lái)打破細(xì)胞本身所固有的局限性，實(shí)現(xiàn)更多大宗化學(xué)品的生物合成。隨著全球?qū)沙掷m(xù)發(fā)展的呼聲越來(lái)越高，未來(lái)，在系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)的知識(shí)背景下，結(jié)合合成生物學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)及基因編輯技術(shù)提供的策略和技術(shù)支持,代謝工程的應(yīng)用范圍將不斷地?cái)U(kuò)大。

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