大蒜皮總黃酮的提取及其抗氧化作用的研究

姜薇薇

(山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品學(xué)院，濟(jì)南 250103)

大蒜(AlliumsativumL.)是我國(guó)傳統(tǒng)的香辛調(diào)味料之一，且具有多種保健功效，包括抗氧化、抗菌、防癌、提高機(jī)體免疫力、預(yù)防心血管疾病等[1]。目前，大蒜果實(shí)已經(jīng)被充分利用和開(kāi)發(fā)，除作為調(diào)味品外，已經(jīng)被加工成大蒜素、大蒜精油、大蒜多酚和大蒜黃酮等多種活性物質(zhì)發(fā)揮其功效[2-5]。然而，與大蒜果實(shí)的利用不同，關(guān)于大蒜皮的研究卻很少見(jiàn)，造成了大蒜資源的浪費(fèi)。

很多研究已經(jīng)表明果皮中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，李玉邯等[6]提取了洋蔥皮中的黃酮類物質(zhì)，并利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝。吳鵬等[7]優(yōu)化了微波提取法提取團(tuán)風(fēng)荸薺皮中總黃酮的工藝參數(shù)，此外，胡椒鮮果果皮中也含有豐富的黃酮類物質(zhì)[8]。同時(shí)，黃酮類物質(zhì)具有多種活性功能，包括抗氧化、抗炎癥、抗衰老、抗運(yùn)動(dòng)疲勞等。王曉波等[9]發(fā)現(xiàn)火龍果皮總黃酮具有良好的抗氧化活性。趙丹等[10]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)分析了藍(lán)莓葉總黃酮的抗炎功效，研究表明藍(lán)莓葉總黃酮可以減少炎癥因子的表達(dá)量，從而發(fā)揮抗炎癥的功效。馬向前等[11]證實(shí)桑葉總黃酮具有較好的抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用，并指出這種抗疲勞作用與桑葉總黃酮較強(qiáng)的自由基清除能力有關(guān)。上述研究表明對(duì)果皮或枝葉中的總黃酮進(jìn)行提取，并對(duì)其進(jìn)行功能活性研究，不僅能夠充分利用現(xiàn)有資源，也可以提高其附加值，具有良好的應(yīng)用潛力。

本研究以大蒜皮為研究對(duì)象，利用超聲波乙醇浸提法對(duì)大蒜皮中的總黃酮進(jìn)行提取，并利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化總黃酮提取參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，利用抗氧化能力評(píng)估實(shí)驗(yàn)探索大蒜皮總黃酮的抗氧化能力，為大蒜的綜合開(kāi)發(fā)利用和功能活性的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜皮：大蒜購(gòu)自沃爾瑪超市，剝皮備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：德思特生物技術(shù)有限公司；濃硫酸：鄒平天鹿化工有限公司；95%乙醇：上海星科生物科技有限公司；5%苯酚：濟(jì)南創(chuàng)世化工有限公司；無(wú)水乙醇：蘇州科倫化工有限公司；鄰苯三酚：山東佰仟化工有限公司；雙氧水：仙桃市成明化工有限公司；硫酸亞鐵：濟(jì)南鑫旺化工有限公司；鄰二氮菲：濟(jì)寧宏明化學(xué)試劑有限公司；維生素C(Vc)：河北源創(chuàng)生物科技有限公司，上述試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1604N電子分析天平 上海丙林電子科技有限公司；FZG系列低溫真空干燥箱 南京凱奧機(jī)械設(shè)備有限公司；LK-2000A搖擺式小型樣品粉碎機(jī) 新昌縣城關(guān)紅利數(shù)控制造廠；渤銳BRC-100A 30 L 超聲波清洗器 鄭州渤銳超聲波設(shè)備有限公司；XZB-UV5100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 深圳市信之邦儀器設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 大蒜皮總黃酮含量的測(cè)定

根據(jù)林海楨等[12]的報(bào)道，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)大蒜皮進(jìn)行低溫真空干燥，之后利用粉碎機(jī)對(duì)干燥的果皮進(jìn)行粉碎，并通過(guò)60目篩子過(guò)篩得到大蒜皮粉末。精密稱取10 g大蒜皮粉末，在不同濃度乙醇中浸泡20 h后進(jìn)行超聲提取，之后對(duì)提取液進(jìn)行抽濾得到大蒜皮總黃酮。測(cè)定大蒜皮總黃酮的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到對(duì)應(yīng)總黃酮的濃度，計(jì)算大蒜皮總黃酮的得率[13]。

式中：C為對(duì)應(yīng)總黃酮的濃度(mg/mL)；V為濾液體積(mL)；W為得率(%)；m為大蒜皮樣品質(zhì)量(g)。

2.2 單因素試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響，并確定最優(yōu)值。超聲溫度分別為60，70，80，90，100 ℃，乙醇濃度分別為50%，60%，70%，80%，90%，超聲時(shí)間分別為20，30，40，50，60 min，料液比(m/V)分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波乙醇浸提法提取大蒜皮總黃酮的工藝，選擇乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間和料液比4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化組合，因素與水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2.4 大蒜皮總黃酮抗氧化作用的研究

通過(guò)大蒜皮總黃酮對(duì)超氧離子和羥基自由基的清除能力評(píng)估其抗氧化能力，利用鄰苯三酚氧化法測(cè)定大蒜皮總黃酮清除超氧陰離子的能力，在320 nm波長(zhǎng)下測(cè)定不同濃度大蒜皮總黃酮的吸光值，計(jì)算超氧陰離子的清除率[14]；利用H2O2/Fe體系反應(yīng)法測(cè)定大蒜皮總黃酮對(duì)羥自由基的消除能力，測(cè)定不同濃度香葉提取物反應(yīng)系統(tǒng)在536 nm下的吸光值，并計(jì)算大蒜皮總黃酮對(duì)羥基自由基的消除能力[15]，公式如下：

式中：A0為添加蒸餾水的吸光度；An為添加抗氧化活性物質(zhì)后的吸光度。

式中：A0為未添加抗氧化活性物質(zhì)和H2O2的吸光度；A1為未添加抗氧化活性物質(zhì)但添加H2O2的吸光度；A2為添加抗氧化活性物質(zhì)但未添加H2O2的吸光度；A3為添加抗氧化活性物質(zhì)和H2O2的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 乙醇濃度對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響

在乙醇濃度分別為50%，60%，70%，80%，90%的水平下分析乙醇濃度對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響。

圖1 乙醇濃度對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of FGP

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，大蒜皮總黃酮得率也隨之增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)趨于穩(wěn)定，綜合考慮成本和總黃酮得率，大蒜皮總黃酮提取的最佳乙醇濃度為80%。

3.1.2 超聲時(shí)間對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響

在超聲時(shí)間分別為20，30，40，50，60 min的條件下分析超聲時(shí)間對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of FGP

由圖2可知，大蒜皮總黃酮的得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)超聲時(shí)間為50 min時(shí)達(dá)到最大值，隨后則隨之下降。這可能是因?yàn)槌曔^(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定程度的振動(dòng)和空化作用，隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)會(huì)對(duì)大蒜皮總黃酮造成破壞，從而導(dǎo)致總黃酮的得率下降，因此大蒜皮總黃酮提取的最佳超聲時(shí)間為50 min。

3.1.3 超聲溫度對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響

在超聲溫度分別為60，70，80，90，100 ℃下分析超聲溫度對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響。

圖3 超聲溫度對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction rate of FGP

由圖3可知，當(dāng)超聲溫度小于80 ℃時(shí)，大蒜皮總黃酮得率隨著超聲溫度的升高而增加，當(dāng)溫度大于80 ℃時(shí)得率下降。這是因?yàn)檫^(guò)高的溫度會(huì)對(duì)黃酮類物質(zhì)造成破壞，從而導(dǎo)致得率下降，因此大蒜皮總黃酮提取的最佳超聲溫度為80 ℃。

3.1.4 料液比對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響

在料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50下分析料液比對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響。

圖4 料液比對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of FGP

由圖4可知，隨著料液比的增加，大蒜皮總黃酮的得率隨之增加，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)得率趨于恒定，因此大蒜皮總黃酮提取的最佳料液比為1∶40。

3.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)確定超聲波乙醇浸提法提取大蒜皮總黃酮的最佳參數(shù)組合，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

續(xù) 表

由表2可知，4個(gè)因素對(duì)大蒜皮總黃酮得率的影響順序?yàn)槌暅囟?C)>料液比(D)>乙醇濃度(A)>超聲時(shí)間(B)；超聲波乙醇浸提法提取大蒜皮總黃酮的最佳因素水平組合為A2B3C2D2，即乙醇濃度80%，超聲時(shí)間60 min，超聲溫度80 ℃，料液比1∶40。按照上述最優(yōu)方案進(jìn)行了3次平行實(shí)驗(yàn)，大蒜皮總黃酮的得率分別為1.36%，1.33%，1.37%，3次實(shí)驗(yàn)的平均值為1.35%，其結(jié)果高于正交試驗(yàn)各組得率。

3.3 大蒜皮總黃酮對(duì)超氧離子的清除能力

大蒜皮總黃酮清除超氧陰離子能力的結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 大蒜皮總黃酮對(duì)超氧離子的清除率Fig.5 Superoxide anion scavenging rate of FGP

大蒜皮總黃酮對(duì)超氧離子的清除能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)濃度達(dá)到0.35 mg/mL時(shí)，大蒜皮總黃酮能夠清除97.23%的超氧陰離子，略低于Vc對(duì)照組。因?yàn)閂c是強(qiáng)的抗氧化劑，因此可以確定大蒜皮總黃酮具有較強(qiáng)的清除超氧離子的能力。

3.4 大蒜皮總黃酮對(duì)羥自由基的清除能力

大蒜皮總黃酮對(duì)羥自由基清除能力的結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 大蒜皮總黃酮對(duì)羥自由基的清除率Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging rate of FGP

大蒜皮總黃酮隨著質(zhì)量濃度的增加，清除羥自由基的能力也隨之增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.3 mg/mL時(shí)，大蒜皮總黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力略低于Vc；大于0.3 mg/mL時(shí)，大蒜皮總黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力高于Vc；當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到0.6%時(shí)，大蒜皮總黃酮能夠清除97.15%的羥自由基，可見(jiàn)大蒜皮總黃酮對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

4 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化超聲波乙醇浸提法提取大蒜皮總黃酮的工藝，結(jié)果表明：大蒜皮總黃酮得率的影響順序?yàn)槌暅囟?料液比>乙醇濃度>超聲時(shí)間，最佳工藝為乙醇濃度80%，超聲時(shí)間60 min，超聲溫度80 ℃，料液比1∶40，在最佳工藝條件下大蒜皮總黃酮的得率為1.35%?？寡趸芰υu(píng)估實(shí)驗(yàn)表明大蒜總黃酮具有良好的清除超氧離子和羥基自由基的能力。本研究對(duì)大蒜皮總黃酮的提取及深度開(kāi)發(fā)具有指導(dǎo)意義。

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