豬腸道杯狀病毒的病原學特征及檢測技術研究進展

莊夕棟

（諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東 諸城 262200）

豬腸道杯狀病毒（Porcine enteric caliciviruses，PECV）是引起豬病毒性腹瀉的病原之一，它屬于杯狀病毒科，包括豬諾如病毒（norovirus，NoV）和豬札幌病毒（sapovirus，SaV）。豬NoV只感染成年豬，且無臨床癥狀；豬SaV可感染各年齡的豬，以2～8周齡仔豬感染率最高，并引起仔豬腹瀉[1]。PECV廣泛分布于世界各地，給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)帶來了一定的損失。

1 病毒的病原學特征

杯狀病毒科（Caliciviridae）的病毒為無囊膜的單股正鏈的RNA病毒。病毒粒子直徑為27～35 nm，含有長度為7～8 kb的基因組[2]。在通常情況下，杯狀病毒在環(huán)境中較為穩(wěn)定，病毒在高溫下和某些化學物質(zhì)（乙醚、氯仿等）作用下失活，PECV在pH 4.5～5.0的酸性條件下結構穩(wěn)定。豬SaV可在豬腎傳代細胞系（LLC-PK）和豬腎原代細胞中進行培養(yǎng)，該病毒是唯一能細胞培養(yǎng)的腸道杯狀病毒[3]。豬NoV由于尚未找到合適繁殖的細胞系，對其理化性質(zhì)和生物性能的研究還尚屬空白。PECV能夠體外培養(yǎng)，但必須在培養(yǎng)基里添加無菌豬腸道內(nèi)容物或膽酸鹽。后來研究證實，腸道培養(yǎng)物中的膽汁酸是病毒復制的活性因子，為豬腸道病毒在豬腎成纖維細胞系中復制所必需[4]。

2 病毒的分類地位

最新的病毒學分類將杯狀病毒分為五個屬，分別是諾如病毒屬（Norovirus，NoV）、 札 幌 病 毒 屬（Sapovirus，SaV）、水皰疹病毒屬（Vesivirus）、兔病毒屬（Lagovirus）和Nebovirus屬[5]。屬于水皰疹病毒屬的豬水皰疹病毒（Vesi cular exanthema of swine virus，VESV）能夠引起豬水皰疹，屬于兔病毒屬的兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic diseas e virus，RHDV）能夠引起兔子致命的出血性疾病。

3 病毒的流行病學與致病性

豬NoV已經(jīng)先后在日本、荷蘭、美國、匈牙利、比利時、中國、韓國等國家檢測出來。對NoV的流行有一項研究，調(diào)查了美國3個州（俄亥俄、密歇根和北卡羅來納）的7個豬場和1個屠宰場不同日齡豬的NoV流行情況。這項研究共采集了621份糞便樣品，RT-PCR檢測的結果顯示，這些豬場以及屠宰場中存在豬NoV的3種基因型，分別是GII-11、18和19。豬GII NoV只從育成豬（20～24周齡）豬群中檢測到，總的流行率在20%左右[6]。不同豬場的流行率差異很大，流行率最高的豬場達70%。保育豬以及斷乳仔豬（20周齡以下）未能檢測到NoV，可能的原因是幼齡仔豬對NoV不易感，這同人類NoV感染類似。也有人指出，檢測豬NoV的PCR引物是根據(jù)人NoV設計的，其靈敏性和特異性不高，在選擇樣品上也不夠全面，未參考斷奶前后的腹瀉仔豬，因此NoV的流行情況和發(fā)病率可能比實際情況更高。

豬SaV廣泛分布于世界各地。根據(jù)美國、荷蘭等國家的研究都顯示了各年齡段的豬群SaV的感染率和血清陽性率均明顯高于NoV，且在不同國家的感染率不同，但通常是2～8周齡仔豬感染率最高。各種豬SaV分離毒株中，最常見的是屬于GⅢ的SaV[7]。豬群中存在NoV和SaV共同感染的現(xiàn)象，發(fā)生腹瀉的仔豬也可能與多種其他腸道病原體（冠狀病毒、輪狀病毒、星狀病毒、嵴病毒和腺病毒等）混合感染，混合感染是否有協(xié)同作用而加劇腹瀉還有待進一步的研究。由于存在隱形排毒以及母豬通過初乳中的母源抗體保護新生仔豬感染和發(fā)病，因此，環(huán)境中可能長期存在病原，病豬經(jīng)糞-口傳播途徑可能是病毒傳播的重要方式。

4 病毒的檢測技術研究進展

4.1 直接電鏡觀察

病毒電鏡（EM）觀察可以直接觀察到病毒粒子，但杯狀病毒科包含的多種病毒在形態(tài)上差異不大，也很難將杯狀病毒和其他腸道病毒如星狀病毒、小核糖核酸病毒相鑒別[9]，因此對檢測人員電鏡觀察的技術水平要求較高，電鏡觀察并不是一種常用的方法。

4.2 ELISA檢測

ELISA可用于檢測血清中的抗體水平，由于SaV病毒樣顆粒（VLP）具有與真病毒相似的形態(tài)和抗原性，而絕大多數(shù)SaV缺乏細胞培養(yǎng)體系，因此重組VLP已被廣泛用作抗體ELISA檢測血清抗體的包被抗原。黃澤彬等[10]（2009）建立了PECV抗體檢測的間接ELISA方法。用該法對湖南省各地區(qū)收集到的42份母豬和96份仔豬血清樣品進行檢測，PECV陽性率分別為83.33%（35/42）和 68.75%（66/96）。表明其所建立的間接ELISA方法適于大規(guī)模的PECV血清流行病學調(diào)查。

4.3 RT-PCR檢測

目前RT-PCR是檢測SaV的首選方法。Jiang等[11]（1999）基于RdRp基因設計一對引物：建立RTPCR方法，廣泛應用于人和多種動物糞便或組織中NoV和SaV的檢測。Martinez等[12]（2004）對委內(nèi)瑞拉7個豬場204份0～9周齡的仔豬糞便樣品進行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)SaV 感 染 率 達 18%（36/204）。Jeong等[13]（2007）對韓國6個地區(qū)78個豬場的糞便樣品進行RT-PCR和套式RT-PCR檢測，SaV陽性率達29.1%（69/237）。黃澤彬等[10]（2009）對湖南地區(qū)多個豬場SaV感染進行流行病學調(diào)查，結果顯示腹瀉糞便樣品中SaV陽 性 率 達 12.7%（24/189）。Valente等[14]（2015）用RT-PCR對巴西169份哺乳母豬、斷奶仔豬、成年豬糞便樣品進行了SaV檢測，陽性率為23.7%（40/169）。陳燕君等（2016）根據(jù)豬NoV保守的RNA依賴性RNA聚合酶（RNA Dependent RNA Polymerase，RDRP）基因序列設計了一套巢式RTPCR引物，建立了檢測豬NoV的巢式RT-PCR檢測方法。應用該方法檢測某豬場健康育肥豬糞便樣品，陽性率為54.5%。RT-PCR為PECV的診斷與監(jiān)測提供了可供借鑒的方法，但上述報道的專門用于檢測豬NoV和SaV的RTPCR方法，特異性和敏感性差別較大。

5 小結

目前對本病尚無特效治療藥物，主要靠加強飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生措施進行預防?？山o發(fā)病豬口服葡萄糖鹽水或復方葡萄糖溶液進行對癥治療。PECV感染將在今后很長一段時間內(nèi)繼續(xù)影響全球的養(yǎng)豬生產(chǎn)，而且該病毒為RNA病毒，具很大的變異潛力，易使病毒毒力增強，從而對養(yǎng)豬業(yè)和人們的健康造成更大的威脅，因而有必要做更深入的研究，以全面了解該病毒的流行病學和生物學特性，從而評價該病毒在引起仔豬尤其是斷奶仔豬腹瀉中所起的作用，進而合理地研制疫苗及制定疾病防控措施。綜上所述，目前PECV的研究主要集中在流行病學方面。人們對PECV的入侵與感染、變異與遷移、免疫與致病、跨物種間感染與傳播、暴發(fā)與流行等病原與宿主互作關系，以及病毒感染宿主的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等規(guī)律的研究尚不深入。豬是PECV最主要的動物宿主，常以亞臨床或隱性感染形式存在于健康豬群。此外，作為導致人與多種動物急性胃腸炎的主要病原體，動物源與人源PECV表現(xiàn)為遺傳上高度同源性，不斷有來源于人和豬的SaV重組新毒株被發(fā)現(xiàn)，均暗示豬可能具備“儲存和整合”SaV的功能，具備潛在的跨物種間感染及傳播給人的威脅，進而引發(fā)人獸共患病及相應的食品安全和公共衛(wèi)生等問題，應引起足夠重視。由于NoV和SaV的高度遺傳變異特性和多樣性及樣品的質(zhì)量和特異性擴增的條件和方法的限制，目前還沒有一種方法能完全準確地檢測到所有型別的PECV。當前，國內(nèi)豬病流行形式十分復雜，各類新老疫病反復出現(xiàn)，有多種新出現(xiàn)的病毒從豬群中分離到。加強對豬NoV和SaV等新出現(xiàn)病毒的研究任重而道遠。