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      鹿結(jié)核病診斷技術(shù)研究進(jìn)展

      2018-01-23 22:38:32劉艷環(huán)谷晨晨李海濤朱言柱常彤王玉芳苗利光莊寶策
      特產(chǎn)研究 2018年3期
      關(guān)鍵詞:結(jié)核結(jié)核病檢測(cè)

      劉艷環(huán),谷晨晨,李海濤,朱言柱,常彤,王玉芳,苗利光※,莊寶策

      (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,長(zhǎng)春 130112;2.吉林省永吉縣一拉溪鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,吉林 永吉 132213)

      結(jié)核?。═uberculosis,TB)是在全球范圍內(nèi)廣泛傳播的一種慢性、消耗性人畜共患傳染病。鹿結(jié)核病主要由牛型結(jié)核分枝桿菌和人型結(jié)核分枝桿菌引起,不僅給養(yǎng)鹿業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失,同時(shí)也是人結(jié)核病的主要傳染源。結(jié)核病的歷史可以追溯到距今約7000年以前,而該病真正被文字所記載則是在公元前460~公元前370年,由古希臘醫(yī)學(xué)家所述,并將該病界定為傳染性疾病。

      結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)和文字記載雖然很早,但是人類一直沒有給予其應(yīng)有的重視,并因此付出了慘痛的代價(jià)。18世紀(jì)的歐洲,因?yàn)榻Y(jié)核病的盛行,歐洲人的平均壽命僅有35歲;發(fā)展到19世紀(jì),由于疾病的大規(guī)模流行,在接近100年的時(shí)間內(nèi),成年人的患病死亡率竟高達(dá)97%。

      1882年,對(duì)結(jié)核病的研究取得了里程碑式突破。德國(guó)科學(xué)家Robert Coch發(fā)明并應(yīng)用了抗酸染色法,成功鑒定出了結(jié)核病的病原結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis),此舉標(biāo)志著對(duì)結(jié)核病的研究進(jìn)入了新紀(jì)元[1]。

      在Coch研究的基礎(chǔ)上,法國(guó)科學(xué)家Calmette和Guerin耗時(shí)13年,經(jīng)過(guò)230余次試驗(yàn),將牛結(jié)核分枝桿菌毒性弱化趨近于零,成功研制出用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗,并于1921年首次臨床試驗(yàn)。1928年,法國(guó)國(guó)家科學(xué)大會(huì)正式將該疫苗命名為卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG),結(jié)核病開始得到遏制。而1943年治療藥物鏈霉素的出現(xiàn),則標(biāo)志著結(jié)核病終于不再是不治之癥。

      結(jié)核病在全球范圍內(nèi)分布很廣,是人類史上持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)的疾病之一,也是單一病原致死人數(shù)最多的疾病。結(jié)核病感染率、死亡率、耐藥率都很高,是可通過(guò)多途徑傳染的人畜共患病[2]。

      結(jié)核病可危害人和多種動(dòng)物,動(dòng)物因其種類多樣性和個(gè)體之間的差異而對(duì)該病呈現(xiàn)或高或低的易感性[3]。在家畜中,牛的易感性最高,尤其是奶牛。家禽和豬的易感性也較強(qiáng),羊則易感性較低,極少患病。在野生動(dòng)物中,鹿最易受到感染,相比于其他動(dòng)物表現(xiàn)出較強(qiáng)的易感性。

      開放型結(jié)核病患者和患病畜禽為主要傳染源,其痰液、乳汁、糞尿和生殖道分泌物中都可攜帶病菌。該病典型的局部病變是在機(jī)體大多數(shù)組織和器官形成結(jié)核結(jié)節(jié)、干酪樣壞死或鈣化結(jié)節(jié)[4]。

      該病感染途徑主要是呼吸道和消化道感染,病菌隨患病個(gè)體的噴嚏和咳嗽排出體外,健康的人、畜吸入外界漂浮的病菌即可被感染[5]。

      我國(guó)的人畜結(jié)核病雖然被有效控制,但是近年來(lái)由于耐藥結(jié)核病的異軍突起,導(dǎo)致現(xiàn)有治療藥物的效果大幅度減退,結(jié)核病疫情又呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。2016年,全球有超過(guò)1 000萬(wàn)的新病例出現(xiàn),給世界各國(guó)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,因此國(guó)際組織和我國(guó)都將結(jié)核病作為重點(diǎn)防治的疾病之一[6]。

      鹿結(jié)核是結(jié)核病的主要傳染源之一,建立有效的鹿結(jié)核病診斷方法意義重大,但是,目前我國(guó)針對(duì)鹿結(jié)核病沒有規(guī)范化的診斷標(biāo)準(zhǔn),主要參照牛結(jié)核病的診斷方法進(jìn)行診斷?,F(xiàn)將鹿結(jié)核病的診斷研究進(jìn)展情況作一綜述。

      1 臨床診斷

      鹿結(jié)核病一般為慢性經(jīng)過(guò),病初癥狀不明顯,隨著病情的發(fā)展,癥狀才逐漸顯現(xiàn),主要表現(xiàn)為食欲不振、食量下降、精神萎靡、進(jìn)行性消瘦等臨床癥狀。根據(jù)病鹿呈現(xiàn)的進(jìn)行性消瘦、被毛粗糙、咳嗽及體表不同部位的腫塊等癥狀,可初步診斷為鹿結(jié)核病。

      2 病理解剖學(xué)診斷

      病理學(xué)檢查是一種以診斷學(xué)和微生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢驗(yàn)方法,相較于其他方法,使用更加普遍并且可靠。由于鹿結(jié)核病與牛結(jié)核病是由同種病原引起,因此兩種疾病的病理變化極為相似。

      鹿結(jié)核病主要病變集中在肺縱隔、體表和腸系膜淋巴結(jié),病變部位出現(xiàn)粟粒至豌豆大小的結(jié)核結(jié)節(jié)。結(jié)節(jié)初期質(zhì)地堅(jiān)硬,后期柔軟,有生面團(tuán)樣觸感,切開后有黃白色膿液流出,無(wú)特殊異味。也有個(gè)別病例會(huì)在胸腔和腸腔的漿膜上出現(xiàn)結(jié)核結(jié)節(jié),多數(shù)為灰黃色、黃豆大小且呈半透明的珍珠狀或葡萄狀,因此又稱為“珍珠樣”結(jié)節(jié),該病灶則稱為“珍珠腫”[6~10]。

      3 病原學(xué)診斷

      病原學(xué)檢查主要包括涂片鏡檢和病原分離鑒定。

      涂片鏡檢對(duì)于開放期病鹿的診斷十分有效。對(duì)病變組織、尿液樣本、糞便樣本處理后進(jìn)行涂片[11],抗酸染色后呈單獨(dú)或成對(duì)存在的紅色平直或稍彎曲的桿菌。在純培養(yǎng)物中菌體則呈細(xì)長(zhǎng)或球桿狀等,形態(tài)多樣,無(wú)芽孢,無(wú)鞭毛,是否具有莢膜有待進(jìn)一步考證。

      有研究證實(shí),改良羅氏培養(yǎng)基(LJ)和丙酮培養(yǎng)基(SP)對(duì)病原菌分離率較高,被認(rèn)定為最適合用于結(jié)核病病原菌的分離和鑒定的培養(yǎng)基[12]。

      4 結(jié)核菌素皮內(nèi)診斷

      目前,世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦使用結(jié)核菌素皮下試驗(yàn)檢測(cè)鹿結(jié)核病,歐洲的諸多國(guó)家通過(guò)該方法有效控制并消滅了結(jié)核菌。該方法通過(guò)對(duì)動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行皮內(nèi)接種結(jié)核菌純化蛋白衍生物(PPD)后觀察接種部位的厚度與硬度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量腫脹情況,即可確診動(dòng)物是否患有結(jié)核病[13,14]。但該方法靈敏度較差,個(gè)體的差異性易導(dǎo)致出現(xiàn)不同的試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果;非特異性較強(qiáng),易受到非致病性分枝桿菌感染的影響,雖然結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性,但多數(shù)鹿并無(wú)病變或無(wú)法分離出致病性結(jié)核桿菌,疑似假陽(yáng)性。因此,應(yīng)用該方法無(wú)法判定鹿是否感染結(jié)核病。該試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果僅能判斷機(jī)體曾感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌,無(wú)法區(qū)分疫苗接種和自然感染[15]。鹿作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,多數(shù)地區(qū)采取檢疫-捕殺的策略,盲目地捕殺造成了一定程度上的經(jīng)濟(jì)損失。

      5 血清學(xué)診斷

      血清學(xué)診斷目前是一種較為可靠的檢測(cè)方法

      5.1 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)

      近些年,隨著酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)診斷技術(shù)的不斷完善,已廣泛被應(yīng)用于各種病原的檢測(cè)。1971年,首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)該疾病的方法,以其具有簡(jiǎn)便快速、敏感性高、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)而快速發(fā)展起來(lái)[16,17]。1976年,該方法正式應(yīng)用于結(jié)核病患畜的血清檢測(cè)。目前,ELISA法檢測(cè)鹿結(jié)核病已得到各個(gè)國(guó)家的認(rèn)可,并利用該方法有效控制了結(jié)核病的傳播,避免了以往所采取的通過(guò)對(duì)野生動(dòng)物大量捕殺這一防控措施。該方法的原理為通過(guò)酶標(biāo)記抗原或抗體來(lái)檢測(cè)對(duì)應(yīng)抗體或抗原,根據(jù)顯色的結(jié)果可以判定陰性、陽(yáng)性[18]。該方法敏感性較高、特異性較強(qiáng),在鹿結(jié)核病的檢測(cè)領(lǐng)域有較好的發(fā)展及應(yīng)用前景[19]。ELISA法作為傳統(tǒng)的檢測(cè)方法的補(bǔ)充試驗(yàn),在機(jī)體反應(yīng)的識(shí)別方面扮演著非常重要的角色[20]。

      但是,結(jié)核分枝桿菌的抗原性相對(duì)較弱,并且種屬間存在相同的抗原決定簇,所以,ELISA檢測(cè)手段在結(jié)核病診斷中并未取得較為實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展,結(jié)核病與體液免疫的相關(guān)性需要更加深入地探究和論述[21]。

      5.2 膠體金診斷法

      1971年,F(xiàn)aulk和Taytor在免疫化學(xué)領(lǐng)域引入膠體金的概念,此后膠體金診斷法作為一種新的免疫學(xué)方法蓬勃發(fā)展,至今已廣泛應(yīng)用于各醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。

      相比于臨床醫(yī)學(xué),在動(dòng)物醫(yī)學(xué)的臨床診斷中,該方法發(fā)展較晚,投入到實(shí)際應(yīng)用中的試劑盒較少。免疫膠體金技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異,可肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果,檢測(cè)結(jié)果易于保存,目前,已開始廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的診斷。

      斑點(diǎn)免疫金滲濾測(cè)定法(Dot immunogold filtration assay,DIG.FA)是免疫膠體金技術(shù)中比較具有代表性的一種方法[22]。但是,該方法有假陰性和假陽(yáng)性,重復(fù)性及靈敏程度也不盡如人意,檢測(cè)的范圍無(wú)法滿足發(fā)展需求[23,24]。

      5.3 IFN-診斷法

      5.4 免疫印跡法

      免疫印跡法(Immunoblottingtest,IBT)又稱為酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(Enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物上,然后利用該蛋白對(duì)應(yīng)一抗以及酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行反應(yīng),并通過(guò)底物顯色檢測(cè)的方法。

      目前,該技術(shù)發(fā)展較為成熟,操作完善、反應(yīng)特異性強(qiáng),可適合大規(guī)模檢測(cè)。該方法已經(jīng)開始應(yīng)用于常見的疫病病原檢測(cè)[28,29]。免疫印跡法缺陷在于其無(wú)法精確定量,存在上樣誤差,并且會(huì)受到信號(hào)雜帶的干擾[30]。

      6 分子生物學(xué)診斷

      6.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)法

      在分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是檢測(cè)鹿結(jié)核病的最常用的方法,無(wú)論是在醫(yī)學(xué)還是獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,該方法都具有巨大的研究?jī)r(jià)值[31]。

      PCR技術(shù)首次于1985年由karymullis發(fā)明。Young等應(yīng)用此方法成功建立了有關(guān)結(jié)核桿菌基因文庫(kù),并成功分離出了結(jié)核桿菌相關(guān)蛋白抗原編碼基因,并予以鑒定。1989年,PCR技術(shù)首次應(yīng)用于結(jié)核病的診斷,并通過(guò)研究證實(shí),其特異性高于ELISA[32~34]。

      6.2 DNA指紋技術(shù)

      DNA指紋是指具有完全個(gè)體特異的DNA多態(tài)性,其個(gè)體識(shí)別能力足以與手指指紋相媲美,可廣泛應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別和親子鑒定等方面。其原理在于DNA指紋的圖像呈條紋狀,酷似條形碼,且圖紋具有唯一性,故稱之為“DNA指紋”[35]。

      DNA指紋技術(shù)常用于菌種的鑒定,找出致病病原,確定流行源頭;還可以用來(lái)辨別感染途徑,以分辨機(jī)體是感染源還是被侵襲體。當(dāng)前主要應(yīng)用的有DRE-PCR、Spoli-gotyping、IS6110-PCR以及PCRRELP 等[36~38]。

      6.3 生物芯片技術(shù)

      1996年,美國(guó)Affymetrix公司成功研制出世界上首批生物芯片,并制作出芯片系統(tǒng),歐洲和日本緊隨其后,我國(guó)對(duì)生物芯片的研究則剛剛起步,從2016起開始快速發(fā)展[39,40]。

      生物芯片(Biochip)技術(shù)是通過(guò)縮微技術(shù)實(shí)現(xiàn)包括抗原在內(nèi)的生物學(xué)組分的檢測(cè),該技術(shù)可用于疾病臨床診斷,目前,處于分子生物學(xué)領(lǐng)域的最前沿[41]。

      6.4 核酸探針法

      核酸探針雜交技術(shù)是指利用核酸變性和復(fù)性的原理,使得帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸片段,和與其互補(bǔ)的核酸序列雜交形成雙鏈,因而能用于樣品中特定基因序列的檢測(cè)[42]。

      核酸探針技術(shù)具有專一性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn),這些優(yōu)勢(shì)使其在生物大分子研究、藥物分析、司法鑒定、臨床疾病診斷和治療等方面都發(fā)揮出巨大作用。

      綜上所述,目前,尚無(wú)有效方法可以在早期診斷出自然感染鹿,并排除BCG免疫的干擾?,F(xiàn)我國(guó)用于鹿結(jié)核病預(yù)防的疫苗為BCG。但是,BCG接種后PPD皮試結(jié)果易呈假陽(yáng)性,應(yīng)用于動(dòng)物的免疫效果并不理想。因此,國(guó)外多數(shù)國(guó)家并未使用BCG,而是主要以“檢疫-捕殺”的政策來(lái)控制結(jié)核病在鹿中的傳播,導(dǎo)致了大量野生動(dòng)物遭到捕殺,由此帶來(lái)的損失難以估量。如何實(shí)現(xiàn)對(duì)鹿結(jié)核病的早期診斷仍是一個(gè)重要課題。

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