MicroRNA-590-5p、microRNA-103、microRNA-34c-5p、Dicer及BRMS-1基因在肺癌中的表達(dá)研究*

陳瑩，張若冰，楊凱云，譚慧，平妮娜，吳錫南，何越峰

（1.昆明醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院胸心外科，云南 昆明 650118）

MicroRNA（miRNA）是非編碼小分子RNA，長度約為22 nt，其被證實(shí)參與細(xì)胞的發(fā)育、代謝，以及細(xì)胞的死亡、凋亡等多種生物活動。近10年來研究證明，miRNA介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1]。肺癌是發(fā)病率、致死率高的疾病，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)正常組織和癌組織中miRNAs表達(dá)存在差異，部分miRNAs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。miRNAs對肺癌的進(jìn)展有影響[2-3]。研究顯示miR-34c-5p和miR-103均可提高細(xì)胞的存活率，并促進(jìn)細(xì)胞的增殖，miR-34c-5p屬于miR-34c家族的一員，在多種腫瘤中呈低表達(dá)，而Dicer蛋白屬于RNAseⅢ家族，與miRNA和siRNA的功能密切相關(guān)，是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）的重要組成部分，并且可以影響細(xì)胞分化[3-4]。BRMS-1可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間縫隙連接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及抑制癌基因的表達(dá)抑制癌轉(zhuǎn)移[2、5]。本文采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），檢測肺癌組織和癌旁組織中miR-590-5p、miR-103、miR-34c-5p、Dicer及BRMS-1的表達(dá)量及相互關(guān)系，分析其與組織類型、臨床指標(biāo)的關(guān)系，探討其在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月-2011年1月于昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院住院患者的手術(shù)切除的肺癌組織及癌旁正常組織，癌旁正常組織離癌組織＞5cm，將選取的組織分為肺癌組織組和正常組織組，每組樣本47例。其中鱗癌15例、腺癌32例?；颊呔鶠闈h族；年齡32～71歲，平均（54.91±9.62）歲；男性32例，女性15例；吸煙29例（62%）；飲酒22例（47%）；低分化18例，中分化28例，高分化1例。32例腺癌的免疫組織化學(xué)指標(biāo)如下，GSTπ：5例陰性（-），15例弱陽性（+），9例陽性（++），3例強(qiáng)陽性（+++）；PgP：7例陰性（-），14例弱陽性（+），9例陽性（++），2例強(qiáng)陽性（+++）；TOPOⅡ：6例陰性弱陰性（-），20例弱陽性（+），6例陽性（++）；肺耐藥蛋白：2例陰性（-），14例弱陽性（+），13例陽性（++），3例強(qiáng)陽性（+++）；與多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）：4例 陰 性（-），13例弱陽性（+），15例陽性（++）；P53：9例陰性（-），15例弱陽性（+），7例陽性（++），1例強(qiáng)陽性（+++）；Ki67：5%～90%平均數(shù)為32.67%。本實(shí)驗(yàn)均取得患者知情同意。

1.2 方法

癌旁正常組織取下后10min內(nèi)放入預(yù)先裝有RNA later（美國Ambion公司）溶液的試管中，先4℃浸泡8 h，然后放入-80℃冰箱中長期保存。通過查閱病理切片記錄確認(rèn)組織病理類型。

1.3 RNA的提取和定量

利用Trizol（美國Invitrogen公司）提取總RNA，NCode ? VILO ? miRNA cDNA Synthesis Kit和 EXPRESS SYBR? GreenER ? miRNA qRT-PCR Kit（美國Invitrogen公司，A11193-052）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以上按說明書步驟操作。引物序列如下，miR-590-5p：CAGGAGCTTATTCATAAAAGTGCAG；miR-34c-5p：AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC；miR-103：CAGCATTGTACAGGGCTATGA ；BRMS1：TGCAGCGGAGCCTCAAG與TCACATCCAGACAG AAGCCCT；Dicer：TGGGTCCTTTCTTTGGACTG 與CTGGTTTGCAGAGTTGACCA。miRNA下游引物為試劑盒提供，利用ABI7900HT（美國ABI公司）對5個RNA進(jìn)行qRT-PCR，2-△△CT表示相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)化后為正態(tài)分布，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基因的表達(dá)特征

兩 組miR-103、miR-34c-5p、Dicer及BRMS-1基因表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中肺癌組織組miR-103、Dicer較正常組織組低，表達(dá)下調(diào)；肺癌組織組BRMS-1、miR-34c-5p較正常組織組高，表達(dá)上調(diào)。見附表。

附表 兩組基因的表達(dá)特征 （n =47，±s）

組別 miR-590-5p miR-103 miR-34c-5p Dicer BRMS-1肺癌組織組 6.53±3.39 3.63±2.10 8.60±2.97 4.67±2.34 5.64±2.57正常組織組 5.77±3.53 7.49±1.75 6.90±3.28 6.76±2.73 2.37±2.33 t值 1.048 9.519 2.602 3.942 6.161 P值 0.149 0.000 0.005 0.000 0.000

2.2 肺癌組織RNA與免疫組織化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性

miR-34c-5p與P53呈正相關(guān)（r=0.402，P=0.034），miR-103與多藥耐藥相關(guān)蛋白呈正相關(guān)（r=0.563，P=0.020），Dicer與P53呈負(fù)相關(guān)（r=-0.381，P=0.040）。

2.3 兩組miRNAs與mRNA的相關(guān)性

正常組織組中Dicer與miR-590-5p、miR-103及miR-34c-5p呈負(fù)相關(guān)（r=-0.382、-0.369和-0.403，P=0.041、0.034和0.023），而肺癌組織組中均未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性。

3 討論

隨著越來越多關(guān)于miRNAs的研究，發(fā)現(xiàn)miRNAs在生物代謝過程中和病理過程中起著重要作用[6-7]。miRNA可影響大多數(shù)目標(biāo)基因表達(dá)，近幾年來大量的miRNA被定義為致癌基因或抑癌基因，比如miR-335、miR-206及miR-126在乳腺癌中視為癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志，宮頸癌中miR-126、miR-143及miR-145和肺癌中的miR-451被視為致癌基因[7-9]。miRNA成熟過程通常是由基因組轉(zhuǎn)錄出初始轉(zhuǎn)錄pri-miRNA，再由Dicer等組成的復(fù)合物切割形成成熟miRNA并加入RISC復(fù)合物，行使其生物學(xué)功能[10-11]。miR-590-5p在宮頸癌、肝癌組織中表達(dá)下調(diào)[10]，而本次研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中的miR-590-5p表達(dá)與癌旁正常組織比較無差異。miR-103在結(jié)腸直腸癌中為致癌基因[11-12]，而本研究證實(shí)miR-103在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)。miR-34c-5p基因的研究甚少，本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織與癌旁正常組織中miR-34c-5p表達(dá)量有差異，在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)。有研究顯示Dicer在乳腺癌、口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌以及其他不同癌組織中表達(dá)異常[13-16]。本研究中Dicer在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)。BRMS-1被證實(shí)在乳腺癌、黑色素癌、卵巢癌及鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)，且可能與癌細(xì)胞的入侵、轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后有關(guān)[17-18]。而在肺癌組織中BRMS-1表達(dá)上調(diào)，其原因需進(jìn)一步研究。

本文肺癌組織中RNA與免疫組織化學(xué)指標(biāo)的關(guān)系相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，miR-34c-5p和P53呈正相關(guān)；miR-103和MRP呈正相關(guān)，Dicer與P53呈負(fù)相關(guān)。肺癌組織和正常組織miRNAs與mRNA的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，正常組織中Dicer與miR-590-5p、miR-103和miR-34c-5p均呈負(fù)相關(guān)，而肺癌組織中未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性。本研究提示癌組織與正常組織的4種基因表達(dá)量有差異，miR-103和Dicer在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR-34c-5p及BRMS-1表達(dá)上調(diào)。Dicer在前體基因轉(zhuǎn)錄為成熟基因過程中起到重要作用，推測肺癌組織中Dicer表達(dá)下調(diào)的原因，miR-34c-5p抑制Dicer基因的表達(dá)，可能由于miR-34c-5p結(jié)合在Dicer的位點(diǎn)上，使Dicer基因降解，而降低基因表達(dá)。

肺癌被視為威脅人類健康最常見的腫瘤之一，缺乏早期診斷方法，使其在世界范圍內(nèi)是病死率最高的腫瘤[19]。本研究得到了miRNAs、mRNA與肺癌之間關(guān)系的流行病數(shù)據(jù)，但研究中對Dicer僅限于關(guān)聯(lián)研究，可進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制方面的深入探索。本次研究的意義在于通過對mRNA與miRNAs關(guān)系的探究，明確肺癌組織miRNAs表達(dá)異常與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)異常表達(dá)有關(guān)，對闡明miRNAs轉(zhuǎn)錄調(diào)控和miRNAs表達(dá)調(diào)控機(jī)制有重要的意義，接下來應(yīng)從機(jī)制研究入手，深度研究Dicer對miR-34c-5p及miR-103基因的影響及其機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)：

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