超聲微泡造影在前列腺癌診治中的研究進展

高宏偉綜述，劉春雨，牛遠杰審校

（天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院尿石癥治療中心，天津市泌尿外科研究所，天津300211）

作為目前對老年男性公民造成巨大傷害的常見病癥，前列腺癌已經(jīng)被人們所認知，它在歐美國家中高發(fā)，但近幾年，前列腺癌在我國的發(fā)病率每年都在不斷攀升。目前，關(guān)于前列腺癌的影像診斷有超聲診斷、CT、核磁共振（MRI）等技術(shù)手段。超聲造影的出現(xiàn)帶來了超聲醫(yī)學的第三次革命，它是利用與人體組織回聲明顯不同的特點，將聲阻抗差異顯著的物質(zhì)注入血管內(nèi)，增強對組織臟器或病變部位的顯示以及血流灌注信息。超聲造影技術(shù)使超聲的無創(chuàng)性觀察活體組織器官的微循環(huán)灌注成為可能，使超聲進入到從形態(tài)學成像過渡到功能性成像的發(fā)展階段[1]。用微泡對比造影劑能夠顯示出前列腺內(nèi)相關(guān)的微血管影，利用偵測前列腺癌內(nèi)部微血管密度升高的變化，進行前列腺癌的診斷[2]。超聲微泡是一種微小的球形氣泡（一般為微米級），其構(gòu)成的核心部分為不同種類的氣體，其外殼由白蛋白、脂類、表面活性劑或可生物降解的高分子材料等不同成分構(gòu)成。超聲微泡造影劑的發(fā)展主要經(jīng)歷了3個階段：第1階段的微泡造影劑用在心臟分流中的診斷，但是其體積較大不能順利通過毛細血管且穩(wěn)定性較差；第2階段的微泡在造影劑第一階段的基礎(chǔ)上縮小了體積、改善了微泡的穩(wěn)定性，但仍然沿用著不穩(wěn)定的氣體作為核心成分；第3個階段有了比較大的變化，它采用惰性氣體制備微泡，使其穩(wěn)定性有了進一步提高，在血液中的半衰期得到了進一步延長[3]。

1　超聲微泡分類

1.1依照微泡核心部位包裹氣體類別的不同，超聲微泡造影劑可以簡單分成兩代。

1.1.1第一代內(nèi)部核心包裹的是最為普通的空氣，而包膜材料則通常由白蛋白或半乳糖等組成。但包膜的彈性比較差，穩(wěn)定性不高，在血液中能夠維持的時間并不長，而且非常容易裂開，所以在臨床應用方面，需要更精準的觀測，以便達到最佳效果。其中，最具代表性的第一代造影劑有Albunex、Echo-vist（SHU-454）和Levovist（SHU-508A）。

1.1.2第二代超聲微泡造影劑包裹包含了高分子量氣體，比如：六氟化硫、全氟丙烷等，微泡的直徑一般在2～5 μm范圍，而且包膜的材料變成了脂質(zhì)體。這一代的微泡造影劑具有穩(wěn)定時間長，振動及回波特性好，顯像穩(wěn)定及清晰的特點。具有代表性的品種有 Aerosomes（DMP-115）、EchoGen、Sonovist（SHU-563A）等。

1.2根據(jù)包裹核心氣體的外部材料不同又可以將微泡超聲造影劑分為4類。

1.2.1白蛋白類這種造影劑的包膜由蛋白質(zhì)構(gòu)成，是由Feinstein等[4]采用超聲聲振的方法制得。其中人血清白蛋白在超聲造影劑的應用和研究最為常見。蛋白類物質(zhì)在超聲輻照的作用下，可以形成具有一定機械強度的薄膜。主要原因是蛋白質(zhì)分子里兩類化學基團（羧基與氨基）合成了氫鍵，這大大加強了分子之間相互的作用力。所以，氣泡包膜的強度通常比較高，而且，在制作白蛋白微泡造影劑時加入一些蔗糖能夠有效提升它的平穩(wěn)性。杜永峰等[5]在蛋白質(zhì)內(nèi)加入不同濃度的鹿糖，采用超聲空化方法制備白蛋白超聲造影劑，研究表明在一定范圍內(nèi)鹿糖濃度的增加會提高微泡的穩(wěn)定性和耐熱性，并且不影響微泡的粒徑分布。這類微泡造影劑代表有Albunex和Optison，如果把它們當作微泡薄膜制成材料，具備著無害、容易制作等若干優(yōu)勢，然而，其缺陷有：不太穩(wěn)定、性價比不高、在某些人體中很容易誘發(fā)免疫反應。

1.2.2表面活性劑類表面活性劑類微泡造影劑有非離子型表面活性劑和離子型表面活性劑，我們一般使用的是前者，這是因為表層活性劑類物質(zhì)會減少溶液表層張力，很容易制造出微泡，會減少制備造影劑難度。氣泡形成過程中，表面活性劑的疏水端和親水端將分別面對氣體與液體。還有，其膜層通常擁有受創(chuàng)后自愈能力。當前被普遍運用到超聲造影劑成膜材料的表面活性劑，其屬于非離子表面活性劑，我們平時最為常見的是Tween與Span系列，例如把它們當作原料制作出來的ST44與ST68系列微泡超聲造影劑。

1.2.3脂類大分子脂質(zhì)是常用的包覆材料，因為脂質(zhì)可以分散在微泡的表面，形成一層致密的外殼，能夠有效阻止微泡內(nèi)部氣體逸出，同時它具有乳化劑的特點，能夠依附在微泡表面可形成界面膜，降低其表面張力。一般它具備以下形式[6]：其一是由脂質(zhì)分子形成的單分子包膜氣泡；其二是具有雙親性的脂質(zhì)體形成的雙分子層構(gòu)造包膜氣泡。脂類包膜造影劑通常較為穩(wěn)定，其粒徑通常很小，在若干微米左右，它本身能夠存留的時間比較長。此外它還具備主動靶向的特點，能夠聚焦于特定部位，做到靶向超聲診療。不過它也有個別缺陷，比如加強顯影時間不長、成本費用不低等等。

1.2.4可生物降解的高分子材料常見有乳酸輕基乙酸共聚物（PLGA）、多聚糖、聚乙二醇（PEG）、海藻酸鹽等。這種材料制得的多聚體微泡超聲造影劑大小分布均一性好，體外儲存時間較長。外殼較白蛋白、表面活性劑和脂類硬，因此其抗壓性和體內(nèi)穩(wěn)定性都有顯著提高。Basude[7]利用對聚合原料類別與條件作出改變，能夠獲得聲學性能可控的微泡，這也是最近國內(nèi)外關(guān)于微泡超聲造影劑的研究重點，其代表產(chǎn)品有 BP127和AI-700。

2　超聲微泡在腫瘤治療中的機制

在較高的聲壓條件下，通常聲壓大于0.6MPa，伴有微泡瞬間劇烈的爆破，產(chǎn)生瞬態(tài)空化，瞬間產(chǎn)生劇烈的能量，伴隨著瞬間的高溫高壓，從而導致周圍血管內(nèi)皮的損傷，進而在小血管中誘導血栓形成，阻斷腫瘤組織的血供[8]，超聲輻照治療后，可以明顯上調(diào)與腫瘤細胞增殖、凋亡相關(guān)的基因表達，從而促進腫瘤細胞的凋亡[9]。這是超聲微泡造影對腫瘤的直接作用。

超聲臨床醫(yī)學一直研究探索的熱點問題就是利用微泡超聲空化作用提升基因轉(zhuǎn)染效率和靶向藥物釋放[10-11]，進而達到控制、削弱腫瘤組織生長，甚至達到將其消滅的目的。腫瘤組織里存在著許多表達的血管內(nèi)皮生長因子以及血管內(nèi)皮細胞酪氨酸激酶受體，這些不單單是化療藥物與腫瘤滋養(yǎng)血管栓塞治療的靶向位點，還能夠被當作靶向微泡的作用位點。經(jīng)過對靶向微泡造影劑攜帶轉(zhuǎn)染基因或化療藥物作出特殊的設(shè)計，可將其徑直作用于腫瘤組織，從而實現(xiàn)腫瘤治愈的目的。而超聲微泡造影劑本身就是一類較好的基因載體，與一般病毒載體比較，其具有較大的體積，能夠攜帶寡反義核苷酸、DNA片段、甚至整個染色體[12]。所以，在微泡上面連接附有腫瘤特異性靶向配體或者是以抗體構(gòu)造超聲靶向微泡，讓微泡能夠和靶組織或器官之間有著更為密切的結(jié)合，就能夠再次提升基因轉(zhuǎn)染效率[13]。Shapiro等[14]用1.4 MHz、200 kPa、100周期脈沖長度和540 Hz脈沖頻率處理注射過50 μg熒光素酶質(zhì)粒DNA的小鼠，治療后4 d，與單獨注射DNA組和DNA聯(lián)合微泡注射組相比，小鼠的生物發(fā)光信號能高出100倍，且沒有組織損傷或脫靶遞送的現(xiàn)像。分析超聲微泡有助于促進基因轉(zhuǎn)染，主要存在兩種機制：首先，誘導胞吞作用引起的細胞膜偏轉(zhuǎn)，第二，微泡噴射誘導細胞膜中的孔的形成。目前有很多研究證明，采取對超聲照射和微泡進行聯(lián)合利用的方式，能夠讓基因轉(zhuǎn)染率得到顯著提升，并有可能為進一步臨床治療提供一種新的更加有效的方法[15-17]。

3　超聲微泡造影在前列腺癌診斷中的作用

前列腺癌主要發(fā)生于前列腺組織的外周帶，早期前列腺癌病灶小且多發(fā)、分布散，極少看到大量壞死和出血，用直腸超聲檢查圖像及Doppler檢查，其具體特征是前列腺外腺中不規(guī)則低回聲區(qū)，不容易跟增生結(jié)節(jié)區(qū)別，而且前列腺腺體內(nèi)血管非常細小，微血管直徑僅有11～51μm，經(jīng)直腸前列腺超聲檢查作為早期篩選的手段之一，雖然比經(jīng)腹超聲檢查具有更高的分辨率，但是由于早期腫瘤病灶不明顯、內(nèi)外腺回聲本身具有差異和部分前列腺癌回聲表現(xiàn)為等回聲等特點，在靈敏度和特異性方面，對早期前列腺癌的診斷還是欠缺的。

利用超聲微泡造影技術(shù)使得超聲的無創(chuàng)性觀察活體組織器官微循環(huán)灌注成為可能，也使得超聲從形態(tài)學成像過渡到功能性成像的階段。超聲造影可以顯著提高前列腺血管成像的分辨率。前列腺靶向穿刺活檢不僅有利于PSA升高的病人前列腺癌的檢出，而且還可以提高對那些常規(guī)穿刺活檢陰性結(jié)果中PSA持續(xù)升高的病人前列腺癌的檢出率。Uemura等[18]通過對71例接受前列腺活檢的患者靜脈注射全氟丁烷微泡造影劑，對得到的造影圖像進行評估和分析，得出結(jié)論，經(jīng)直腸超聲造影靶向前列腺穿刺活檢可以提高前列腺癌的檢出率，能夠進行更少數(shù)量的活組織檢查和更準確的前列腺癌的診斷。超聲微泡造影在前列腺癌的檢測和調(diào)高前列腺穿刺活檢準確度方面起到重要作用。

然而，靶向超聲造影劑的應用使前列腺癌的超聲顯像得到進一步的準確與清晰。靶向超聲微泡借助微泡表層特有的生物學特征，或者經(jīng)過對微泡表面作出特別加工構(gòu)造而成。通過靜脈注射可以讓這些微泡靶向性匯集在一起，然后長時間停留在靶組織或靶器官里面。特異性靶向超聲微泡表層攜帶能夠辨識靶分子水平的分子探針，它可以跟組織器官上的靶分子特異結(jié)合，進一步讓器官在超聲影像里面，其特異性能夠加強，或是起到部分靶向治療功效[19]。

前列腺特異性膜抗原 (PSMA)位于前列腺細胞膜上，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，在前列腺癌細胞膜上高表達，PSMA在前列腺癌細胞膜上特異性表達，是前列腺癌尤其是轉(zhuǎn)移性癌及激素難治性前列腺癌高度相關(guān)的生物學標志和診治靶點。PSMA包括750個氨基酸序列，具有較大的胞外區(qū)（44～750氨基酸），能提供多個與其他物質(zhì)結(jié)合的位點。當前已針對PSMA制備了多種能夠與PSMA相結(jié)合的物質(zhì)，包括肽段、小分子化合物及適體等。研究表明，以PSMA抗體為靶向的納米超聲微泡，能穿過腫瘤血管進入組織間隙、與前列腺癌細胞特異性靶向互相結(jié)合，能夠做到前列腺癌組織特異性顯像，從而給前列腺癌前期診療與靶向治療打好根基[20]。Fan[21-22]通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)構(gòu)建的攜帶抗PSMA“靶向”納米微泡，對3種細胞（LNCaP，C4-2和MKN45）構(gòu)建的腫瘤模型進行超聲成像檢查，對比指標的評估，結(jié)果顯示，靶向納米氣泡顯示與空白納米氣泡相比，具有顯著差異。他們并制備了攜帶抗PSMA A10-3.2適體的靶向納米微泡，通過實驗證實了在前列腺癌超聲檢查中，就有靶向成像的作用。

4　超聲微泡造影在前列腺癌治療中的研究

近年來，醫(yī)學界對于超聲微泡造影的研究繼續(xù)加深，很多人認為超聲微泡造影劑不單單是一類性能優(yōu)越的超聲顯像對比劑，它還是一類關(guān)鍵的藥物運輸載體[23]。目前研究的超聲微泡造影劑直徑為1～8 μm，它能在血管腔中保持相對穩(wěn)定并可順利通過肺循環(huán)[24]，實現(xiàn)全身器官組織、尤其是血管較豐富的組織區(qū)域，如心臟、富血管的腫瘤等組織的顯像，并提高顯影的清晰度[25]，但若作為一種藥物遞送載體，這種造影劑缺乏特異性，且與病變的組織不能特異性結(jié)合。但是，靶向超聲造影劑能夠做到把特異性抗體或配體接連至微泡造影劑表面，并依托抗原-抗體或配體-受體之間的特異性結(jié)合，經(jīng)由血液循環(huán)累積到特異的靶器官或靶組織，最終讓器官或組織在超聲顯影中其特異性能夠得到強化。微泡攜帶藥物或基因的方式也有多種：（1）將藥物或基因直接粘附于殼膜表面；（2）將藥物或基因以非共價形式結(jié)合到殼膜表面；（3）將藥物或基因插入殼膜中；（4）將藥物或基因包裹在脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)外層之間；（5）將藥物或基因包裹入微泡內(nèi)部[26]。

目前，對超聲微泡造影在前列腺癌治療中的作用的研究尚處于試驗階段。Eggen等[27]對超聲微泡造影技術(shù)研究表明在前列腺轉(zhuǎn)移癌中的藥物的傳遞、釋放和微觀分布都有明顯的增強。Fan等[28]將帶有前列腺癌的小鼠分成DOX組、DOX+NB組、DOX+US組、DOX+NB+US組，結(jié)果顯示，與其他組相比，DOX+NB+US組中可以看見更多的通過超聲靶向微泡破壞，可以明顯增強前列腺癌小鼠中硝酸鑭顆粒進入實質(zhì)細胞。證實了超聲靶向微泡破壞技術(shù)是促進藥物在超聲輻射部位發(fā)揮作用的有效辦法，分析其潛在的機制可能與空化效應有關(guān)。Wang等[29]研究表明，通過低頻低能超聲照射攜帶米托蒽醌（MIT）的微泡，增加了腫瘤細胞尤其是藥物抵抗細胞對化療藥的攝取，從而提高MIT對前列腺癌DU145細胞療效，并能夠減少MIT的副作用。Wei等[30]研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡參與了細胞外基質(zhì)的降解，抑制了MMP-2和MMP9的活力，這對癌細胞的侵襲和遷移起著重要的作用?？赡芘c超聲微泡通過下調(diào)PC3中的MMP2，MMP9表達有關(guān)，從而起到抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。通過超聲微泡造影技術(shù)，納米微泡攜帶的藥物或特異性抗體能夠靶向進入前列腺癌組織中，從而發(fā)揮更有效的抗腫瘤作用，同時，減少了藥物全身毒性作用，是一種很有發(fā)展前景的技術(shù)手段。

參考文獻:

[1]Wilson S R,Burns P N.Microbubble-enhanced US in body imaging:what role[J].Radiology,2010,257(1):24

[2]Smeenge M,Mischi M,Laguna P,et al.Novel contrast-enhanced ultrasoundimaginginprostatecancer[J].WorldJUrol,2011,29(5):581

[3]Pitt W G,Husseini G A,Staples B J.Ultrasonic drug delivery-a general review[J].Expert Opin Drug Deliv,2004,1(1):37

[4]Feinstein S B,Ten C,Zwehl W,et al.Two-dimensional contrast echocardiography in vitro development and quantitative analysis of echo contrast agents[J].J Am Coll Cardiol,1984,3(1):14

[5]杜永峰,萬明習,趙文明.含蔗糖白蛋白包膜微泡超聲造影劑制備研究[J].藥學學報,2001,36(11):859

[6]Bauer A,Solbiati L,Weissman N.Ultrasound imaging with SonoVue:low mechanical index real-time imaging[J].Acad Radiol,2002,9(Suppl 2):S282

[7]Basude R,Duckworth J W,Wheatley M A.Influence of environmental conditions on a new surfactant-based contrast agent:ST68[J].Ultrasound Med Biol,2000,26(4):621

[8]Shi W T,Forsberg F,Vaidyanathan P,et al.The influence of acoustictransmitparametersonthedestructionofcontrast microbubbles in vitro[J].Phys Med Biol,2006,51(16):4031

[9]Tabuchi Y,Takasaki I,Zhao Q L,et al.Genetic networks responsive tolow-intensitypulsedultrasoundinhumanlymphomaU937 cells[J].Cancer Lett,2008,270(2):286

[10]Cochran M C,Eisenbrey J,Ouma R O,et al.Doxorubicin and paclitaxel loaded microbubbles for ultrasound triggered drug delivery[J].Int J Pharm,2011,414(1/2):161

[11]Stride E P,Coussios C C.Cavitation and contrast:the use of bubbles in ultrasound imaging and therapy[J].Proc Inst Mech Eng H,2010,224(2):171

[12]Li X H,Zhou P,Wang L H,et al.The targeted gene(KDRP-CD/TK)therapy of breast cancer mediated by SonoVue and ultrasound irradiation in vitro[J].Ultrasonics,2012,52(1):186

[13]Phillips L C,Klibanov A L,Wamhoff B R,et al.Targeted gene transfection from microbubbles into vascular smooth muscle cells using focused,ultrasound-mediated delivery[J].Ultrasound Med Biol,2010,36(9):1470

[14]Shapiro G,Wong A W,Bez M,et al.Multiparameter evaluation of in vivo gene delivery using ultrasound-guided,microbubble-enhanced sonoporation[J].J Control Release,2016,223(223):157

[15]Xiang X,Tang Y,Leng Q,et al.Targeted gene delivery to the synovial pannus in antigen-induced arthritis by ultrasound-targeted microbubble destruction in vivo[J].Ultrasonics,2016,65(65):304

[16]Jing H,Cheng W,Li S,et al.Novel cell-penetrating peptide-loaded nanobubbles synergized with ultrasound irradiation enhance EGFR siRNA delivery for triple negative breast cancer therapy[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2016,146(146):387

[17]Schlegel P,Huditz R,Meinhardt E,et al.Locally targeted cardiac gene delivery by AAV microbubble destruction in a large animal model[J].Hum Gene Ther Methods,2016,27(2):71

[18]Uemura H,Sano F,Nomiya A,et al.Usefulness of perflubutane microbubble-enhanced ultrasound in imaging and detection of prostate cancer:phase II multicenter clinical trial[J].World J Urol,2013,31(5):1123

[19]Klibanov A L.Microbubble contrast agents:targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications[J].Invest Radiol,2006,41(3):354

[20]Wang L,Li L,Guo Y,et al.Construction and in vitro/in vivo targeting of PSMA-targeted nanoscale microbubbles in prostate cancer[J].Prostate,2013,73(11):1147

[21]Fan X,Wang L,Guo Y,et al.Ultrasonic nanobubbles carrying Anti-PSMA nanobody:construction and application in prostate cancer-Targeted imaging[J].PLoS One,2015,10(6):e0127419

[22]Fan X,Guo Y,Wang L,et al.Diagnosis of prostate cancer using anti-PSMA aptamer A10-3.2-oriented lipid nanobubbles[J].Int J Nanomedicine,2016,11:3939

[23]Tinkov S,Bekeredjian R,Winter G,et al.Microbubbles as ultrasound triggered drug carriers[J].J Pharm Sci,2009,98(6):1935

[24]Taniyama Y,Tachibana K,Hiraoka K,et al.Local delivery of plasmid DNA into rat carotid artery using ultrasound[J].Circulation,2002,105(10):1233

[25]Ter Haar G R.Ultrasonic contrast agents:safety considerations reviewed[J].Eur J Radiol,2002,41(3):217

[26]Kang S T,Yeh C K.Ultrasound microbubble contrast agents for diagnostic and therapeutic applications:current status and future design[J].Chang Gung Med J,2012,35(2):125

[27]Eggen S,Fagerland S M,M?rch,et al.Ultrasound-enhanced drug delivery in prostate cancer xenografts by nanoparticles stabilizing microbubbles[J].J Control Release,2014,187:39

[28]Fan X,Wang L,Guo Y,et al.Inhibition of prostate cancer growth using doxorubicin assisted by ultrasound-targeted nanobubble destruction[J].Int J Nanomedicine,2016,11:3585

[29]Wang Y,Bai W K,Shen E,et al.Sonoporation by low-frequency and low-power ultrasound enhances chemotherapeutic efficacy in prostate cancer cells in vitro[J].Oncol Lett,2013,6(2):495

[30]Wei C,Bai W K,Wang Y,et al.Combined treatment of PC-3 cells withultrasoundandmicrobubblessuppressesinvasionand migration[J].Oncol Lett,2014,8(3):1372