李夏瑩， 高鴻飛， 劉鵬程， 王顥潛， 梁晉剛， 張旭冬， 李文龍， 張秀杰

(1.農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100176； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢 430062)

轉(zhuǎn)基因生物(genetically modified organism，GMO)一般是指通過(guò)基因工程技術(shù)將具有特殊功能的外源基因轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，使其表達(dá)，從而使生物體獲得它本身不具有的新特性，這樣一類獲得外源基因的生物稱之為轉(zhuǎn)基因生物[1-4]。當(dāng)前轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物領(lǐng)域。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自1996年轉(zhuǎn)基因作物被允許商業(yè)化種植以來(lái)，截至2016年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積從170萬(wàn)hm2增加到 1.851億hm2，增加了110倍。21年間(1996—2016年)，全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積達(dá)到空前的21億hm2[5]。目前有美國(guó)、阿根廷、加拿大等26個(gè)國(guó)家種植了轉(zhuǎn)基因作物，其中19個(gè)為發(fā)展中國(guó)家，7個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家。發(fā)展中國(guó)家的種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的54%，而發(fā)達(dá)國(guó)家的種植面積占46%。已經(jīng)商業(yè)化大面積種植的轉(zhuǎn)基因作物種類主要是玉米、大豆、棉花和油菜。除此之外，轉(zhuǎn)基因作物也擴(kuò)展到了甜菜、木瓜、茄子、馬鈴薯以及2017年剛上市的蘋果等。

轉(zhuǎn)基因作物的迅速普及，為農(nóng)民乃至為全社會(huì)帶來(lái)了巨大的農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，但同時(shí)也引發(fā)了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境的廣泛爭(zhēng)論。為了滿足廣大消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)以及國(guó)際貿(mào)易的需求，許多國(guó)家或地區(qū)相繼出臺(tái)了轉(zhuǎn)基因生物安全管理相關(guān)法律法規(guī)。目前已有65個(gè)國(guó)家或地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行強(qiáng)制標(biāo)志管理制度，如日本和韓國(guó)等國(guó)家的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)志制度要求產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分含量超過(guò)5%或者3%的必須實(shí)施標(biāo)志，而歐盟的要求更為嚴(yán)格，要求0.9%以上必須標(biāo)志。我國(guó)于2001年也公布并實(shí)施了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，并于同年公布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》等3個(gè)配套管理辦法，要求對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄的產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格的標(biāo)志管理制度[6]。然而，近年來(lái)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品非法進(jìn)口、污染及安全事故等事件不斷增加，因此，加大對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)監(jiān)管十分必要。隨著轉(zhuǎn)基因作物的種植面積以及相關(guān)國(guó)際貿(mào)易的不斷增加，建立簡(jiǎn)單便捷的轉(zhuǎn)基因現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速篩查方法對(duì)于實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的有效監(jiān)管十分關(guān)鍵。

目前對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)方法主要分為2類：第一類是基于外源基因檢測(cè)的PCR方法，該方法是通過(guò)PCR技術(shù)和核酸探針的雜交檢測(cè)技術(shù)來(lái)準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)外源基因；二是基于外源基因表達(dá)的特異性蛋白檢測(cè)的免疫方法，這類方法是利用制備的特異性抗體和轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)的外源蛋白的免疫結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)特異、快速的轉(zhuǎn)基因分析。對(duì)于外源蛋白的快速檢測(cè)主要采用酶聯(lián)免疫吸附分析、免疫層析分析和生物傳感器分析等方法。對(duì)于外源基因的快速檢測(cè)方法主要采用基因組DNA直接提取法、核酸等溫?cái)U(kuò)增法以及核酸試紙條等方法?，F(xiàn)將目前廣泛使用的幾種轉(zhuǎn)基因作物快速檢測(cè)技術(shù)綜述如下：

1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)指將抗原或者抗體結(jié)合到固相載體上，利用抗原抗體特異性反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，最后通過(guò)酶與底物顯色來(lái)進(jìn)行定性或者定量的檢測(cè)方法[7]。

這一方法的基本原理是：(1)首先將抗原或者抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體表面，該過(guò)程在溫和條件下進(jìn)行以利于保持免疫吸附劑的免疫活性。(2)同時(shí)將酶標(biāo)記相應(yīng)的抗原或者抗體以制備信號(hào)探針，該信號(hào)探針?lè)肿蛹缺Ａ裘庖呶镔|(zhì)的免疫活性，又保留酶的活性。(3)在測(cè)定中，待測(cè)物和信號(hào)探針按照不同的步驟與固相載體表面的抗原或者抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，經(jīng)過(guò)洗滌等理化步驟使固相載體上結(jié)合的免疫復(fù)合物與溶液中游離的免疫物質(zhì)分離，此時(shí)固定的酶量與待測(cè)物的量成一定的比例。(4)最后向固相載體上加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化而發(fā)生顏色變化，根據(jù)產(chǎn)物的顏色深淺對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量分析。

根據(jù)操作步驟的不同，該法通?？煞譃閵A心法、競(jìng)爭(zhēng)法和間接法3種類型。

相比于其他方法，該測(cè)定法是基于抗原抗體的特異性反應(yīng)，因此具有高度的特異性并且無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理。同時(shí)在該測(cè)定法中酶標(biāo)記物較穩(wěn)定，試劑保存期長(zhǎng)；產(chǎn)生的信號(hào)用普通的可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)就可測(cè)定，不需要昂貴的儀器設(shè)備，因此檢測(cè)成本低廉。此外該方法還具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作等優(yōu)點(diǎn)?；谝陨咸攸c(diǎn)，ELISA已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷工作等領(lǐng)域中，并已成為商業(yè)化程度最高的免疫分析方法。

目前應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)的ELISA試劑盒已被成功開(kāi)發(fā)，如EnviroLogix公司的Cry1Ab/Cry1Ac定量檢測(cè)試劑盒和CP4-EPSPS定量檢測(cè)試劑盒等。

Tan等利用豌豆種子提取的CpT1蛋白制備相應(yīng)的單抗，隨后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，建立了雙抗夾心式ELISA法，可實(shí)現(xiàn)快速、有效的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花檢測(cè)[8]。

值得注意的是在ELISA法中標(biāo)記酶不像同位素/熒光標(biāo)記物那樣能直接產(chǎn)生信號(hào)，而必須要和其他試劑，如酶底物、輔酶的參與，才能完成酶反應(yīng)，引起吸光譜等變化后方可進(jìn)行測(cè)定；同時(shí)由于采用肉眼可見(jiàn)的比色法檢測(cè)，使得其靈敏度受到一定的限制。

2 試紙條法

試紙條(test strip)是近年來(lái)興起的一種基于薄層層析膜的分析方法。試紙條通常是由樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸收墊組成。反應(yīng)膜上存在檢測(cè)線和質(zhì)控線。該分析方法的基本原理是樣品加入樣品墊后，在反應(yīng)膜毛細(xì)管作用下和結(jié)合墊上的示蹤分子一起流經(jīng)固定有生物識(shí)別分子的檢測(cè)線，并與固定的生物識(shí)別分子發(fā)生反應(yīng)形成復(fù)合物，繼而在檢測(cè)區(qū)域顯示示蹤分子的顏色，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品的檢測(cè)。

在試紙條中，反應(yīng)膜的功能是利用其對(duì)生物大分子的吸附特性而固定抗體等物質(zhì)，同時(shí)驅(qū)使樣品以及示蹤分子流向反應(yīng)區(qū)域。因此該反應(yīng)膜需具備良好的蛋白吸附能力，并且需要具有一定的孔隙度和濕潤(rùn)性以保證水溶性樣品的毛細(xì)遷移，目前應(yīng)用最廣泛的是硝酸纖維素膜。

根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)的種類不同，試紙條可分為免疫層析試紙條(immunochromatographic test strip)和核酸試紙條(nucleic acid test strip)。

2.1 免疫層析試紙條法

免疫層析試紙條是將薄層層析分析與傳統(tǒng)的免疫分析相結(jié)合而發(fā)展的一種新型分析方法[9-12]。

免疫層析試紙條的基本原理是將特異性抗體預(yù)先固定在硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)域，當(dāng)膜的一端浸入樣品后，在毛細(xì)管作用下，樣品將沿著該反應(yīng)膜向前遷移。當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中待測(cè)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合。若用免疫膠體金示蹤或者免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)快速簡(jiǎn)便的免疫分析。

相比于傳統(tǒng)的免疫分析，如ELISA法等，免疫層析試紙條無(wú)需較長(zhǎng)的孵育時(shí)間和多步清洗步驟，因此可以顯著簡(jiǎn)化分析流程，縮短分析時(shí)間，已成為體外快速診斷領(lǐng)域發(fā)展的趨勢(shì)性方法。

目前在免疫層析試紙條中應(yīng)用最為廣泛的是膠體金免疫層析技術(shù)(gold immunochromatographic assay，GICA)[13-16]。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單快速、結(jié)果容易判定、安全無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。GICA的基本原理是以硝酸纖維素膜為固相載體，以膠體金作為示蹤標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗體，在反應(yīng)膜毛細(xì)管作用下，基于抗原抗體的特異性反應(yīng)和膠體金特有的顏色對(duì)金標(biāo)抗體與抗原的免疫結(jié)合進(jìn)行示蹤，顯示肉眼可見(jiàn)的紅色條帶，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

根據(jù)膠體金標(biāo)記目標(biāo)物的不同通?？煞譃閵A心法和競(jìng)爭(zhēng)法。夾心法主要針對(duì)大分子待測(cè)物，而對(duì)于小分子待測(cè)物因其分子量比較小，空間結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，一般采用競(jìng)爭(zhēng)法。

在夾心法中，當(dāng)檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶時(shí)，表明結(jié)果判讀為陽(yáng)性。僅質(zhì)控線出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶，則結(jié)果判讀為陰性。在競(jìng)爭(zhēng)法中，結(jié)果判讀與之相反。值得說(shuō)明的是無(wú)論哪種分析類型，若質(zhì)控線未出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的色帶，則表明試紙條變質(zhì)失效。

膠體金免疫層析試紙條在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中發(fā)揮了日益重要的作用。如美國(guó)檢測(cè)StarLink玉米中的Cry9C蛋白的試紙條已成為美國(guó)官方的檢測(cè)方法。在國(guó)內(nèi)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所研制的Cry1Ab/Ac蛋白檢測(cè)試紙條等產(chǎn)品已經(jīng)量化生產(chǎn)并得到農(nóng)業(yè)部的推薦使用。

此外，Kumar等合成營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(Vip)的重組抗原，并制備相應(yīng)的抗體，將膠體金標(biāo)記抗體作為信號(hào)探針，繼而制備免疫層析試紙條。該方法基本無(wú)交叉干擾，可實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、特異的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)[17]。

免疫層析試紙條是一種快速簡(jiǎn)便的定性檢測(cè)方法，將試紙條放在待測(cè)樣品抽提物中，5～10 min就可得出結(jié)果，不需要特殊儀器和熟練技能。轉(zhuǎn)基因蛋白快速檢測(cè)試紙條的成功研制，為轉(zhuǎn)基因作物的篩查和監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持平臺(tái)。這類試紙條非常適合于可以強(qiáng)表達(dá)外源蛋白的Cry1Ab/Ac、CP4EPSPS和bar等基因的快速篩查。按照合適的采樣步驟，免疫層析試紙條可以在給定的一批樣品中以99%的置信水平檢測(cè)出少于0.15%的轉(zhuǎn)基因成分。

但是目前大多數(shù)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因蛋白試紙條只能檢測(cè)1種蛋白質(zhì)，并且無(wú)法有效地檢測(cè)外源蛋白發(fā)生降解或者結(jié)構(gòu)改變的深加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品等。同時(shí)蛋白檢測(cè)試紙條只能檢測(cè)有無(wú)外源蛋白存在而不能識(shí)別不表達(dá)蛋白的特異轉(zhuǎn)化元件，以及區(qū)分具體的轉(zhuǎn)基因品種。

2.2 核酸試紙條法

核酸試紙條是將聚合酶鏈反應(yīng)與試紙條技術(shù)結(jié)合而發(fā)展的一種分析方法[18-19]。

核酸試紙條的基本原理通常是利用一對(duì)分別修飾有熒光素和生物素的特異性引物擴(kuò)增待測(cè)核酸。擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)需純化，加入試紙條后，在毛細(xì)管作用下向前遷移。當(dāng)有擴(kuò)增產(chǎn)物存在時(shí)，一端修飾有生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物首先與結(jié)合墊上標(biāo)記鏈霉親和素的示蹤分子結(jié)合，繼而被捕獲在固定有熒光素抗體的檢測(cè)線上，產(chǎn)生示蹤分子的顏色條帶。無(wú)論擴(kuò)增產(chǎn)物存在與否，修飾有親和素的示蹤分子都會(huì)被固定在質(zhì)控線上的生物素所捕獲，以完成對(duì)核酸試紙條的質(zhì)控。

核酸試紙條技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面已經(jīng)有了成功的報(bào)道。如Kalogiani等首次構(gòu)建了基于膠體金作為示蹤標(biāo)記物的核酸試紙條，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中特異轉(zhuǎn)化元件CaMV35s和NOS。該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果能夠用裸眼判讀、無(wú)需特殊檢測(cè)儀器[20]。

最近，Cheng等利用DNA酶增強(qiáng)的膠體金作為示蹤物質(zhì)，建立基于多標(biāo)記環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的多組分核酸試紙條，用于檢測(cè)多個(gè)轉(zhuǎn)化事件堆積的轉(zhuǎn)基因大豆(DP305423×GTS 40-3-2)。該方法能夠靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速地實(shí)現(xiàn)具有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[21]。

核酸試紙條可以不依賴較為繁瑣耗時(shí)的電泳檢測(cè)技術(shù)或者較為昂貴的熒光檢測(cè)儀，能夠大大縮短核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)時(shí)間，降低分析成本，并能準(zhǔn)確識(shí)別特異性轉(zhuǎn)化元件，尤其適用于深加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品或者具有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速檢測(cè)。但是由于修飾的特異性引物在擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生引物間二聚體，因此會(huì)導(dǎo)致核酸試紙條出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物易受到交叉污染，因此核酸試紙條常需要配置防污染封閉式裝置，從而提高了試紙條成本。

3 轉(zhuǎn)基因生物傳感器檢測(cè)

生物傳感器(biosensor)是生物、化學(xué)、物理、電子信息技術(shù)等多種學(xué)科互相滲透而發(fā)展的一種高新技術(shù)[22-24]。生物傳感器由生物敏感膜和理化換能器組成，其基本原理是分析物擴(kuò)散進(jìn)入固定化生物敏感膜層，經(jīng)分子識(shí)別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)，該信號(hào)繼而被相應(yīng)的理化換能器轉(zhuǎn)變成可處理的光電信號(hào)，再經(jīng)檢測(cè)放大器放大并輸出，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)分析物的檢測(cè)。生物敏感膜又稱分子識(shí)別元件，是生物傳感器的關(guān)鍵元件，可以由酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織和核酸等生物活性物質(zhì)組成。換能器又稱信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，其作用是將各種生化和物理的信息轉(zhuǎn)換成光電信號(hào)，通常包括電化學(xué)電極、光敏元件、熱敏元件、半導(dǎo)體和壓電裝置等。

根據(jù)使用的識(shí)別元件的不同，生物傳感器可分為酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器、微生物傳感器、?xì)胞生物傳感器和組織生物傳感器等。根據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)化方式的不同又可分為電化學(xué)生物傳感器、光學(xué)生物傳感器、熱生物傳感器、壓電生物傳感器和磁生物傳感器等。

生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快、分析通量高、成本低以及在復(fù)雜體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測(cè)等突出優(yōu)點(diǎn)。特別是非常容易實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化、微型化和集成化，使得生物傳感器在多個(gè)研究領(lǐng)域獲得廣泛的關(guān)注和蓬勃的發(fā)展。生物傳感器非常適合轉(zhuǎn)基因的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速篩查，并已在相關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品研究中取得了突破性進(jìn)展。

目前，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)研究的生物傳感器主要有光學(xué)生物傳感器如表面等離子共振傳感器、壓電生物傳感器如石英晶體微天平傳感器、電化學(xué)生物傳感器等。

Mariotti等構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)表面等離子共振傳感器。能夠識(shí)別35S啟動(dòng)子或NOS終止子序列的單鏈DNA探針首先被固定在傳感器芯片表面，繼而與轉(zhuǎn)基因大豆中提取并擴(kuò)增的目標(biāo)轉(zhuǎn)基因片段發(fā)生雜交反應(yīng)。通過(guò)監(jiān)控雜交前后信號(hào)的變化可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、特異和快速的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)[25]。該研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)石英晶體微天平傳感器。將寡核苷酸探針固定在傳感器表面，同時(shí)提取并擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因作物的基因組DNA，再經(jīng)熱變性、磁分離和酶作用獲得單鏈DNA片段，通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)DNA分子與固定的核酸探針雜交后的信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分分析[26]。

最近，Zhou等提出了一種電化學(xué)傳感器，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因外源蛋白。在研究中，特異性的納米抗體作為識(shí)別元件并修飾在電極上，通過(guò)π-π交聯(lián)的石墨烯/硫槿復(fù)合物作為電化學(xué)信號(hào)探針并標(biāo)記納米二抗。該復(fù)合探針不僅可以提供大量的抗體結(jié)合位點(diǎn)而且具有高效的電子轉(zhuǎn)移效率，因此能夠?qū)崿F(xiàn)高特異、高靈敏分析[27]。

然而，由于傳感器中生物識(shí)別元件具有不穩(wěn)定性和易變性等缺點(diǎn)，使生物傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差。目前大量研究工作還處于針對(duì)轉(zhuǎn)基因生物傳感器檢測(cè)方法學(xué)的初步建立階段，離傳感器的商業(yè)化應(yīng)用還有較長(zhǎng)的距離。

4 基因組DNA直接提取法

在核酸分析中，常常涉及一系列操作步驟，包括樣品研磨，核酸提取，PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析或者熒光檢測(cè)。DNA提取的方法有很多，如CTAB法、核酸提取試劑盒法等。但是這些方法需要繁瑣的核酸抽提、沉淀、洗脫等多個(gè)步驟以及數(shù)個(gè)小時(shí)的提取時(shí)間，并且CTAB法需要用到氯仿等有毒試劑，而試劑盒提取成本較高。因此，傳統(tǒng)的核酸提取方法不利于大量樣品的分析和檢測(cè)，難以滿足建立在核酸分析基礎(chǔ)上開(kāi)展的大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)分析的要求。

為了克服以上技術(shù)難題，基因組DNA直接提取法(genomic DNA direct-extraction assay)近年來(lái)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。該方法的基本原理是利用EDTA、表面活性劑、蛋白變性劑以及緩沖液等物質(zhì)混合成裂解液，在適宜溫度下，10 min內(nèi)即可一步完成樣品中基因組DNA的提取，提取的DNA無(wú)需純化即可直接作為PCR模板進(jìn)行有效擴(kuò)增。與已有的DNA提取方法相比，該直接提取法可大大縮短DNA提取時(shí)間，減少操作的繁瑣性，實(shí)現(xiàn)核酸分析法的快速檢測(cè)和大量篩查。

基因組DNA直接提取法已成功應(yīng)用于動(dòng)物組織DNA提取、植物侵染病毒檢測(cè)以及病原菌監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。目前，該方法也開(kāi)始應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，如中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所研制的轉(zhuǎn)基因直擴(kuò)檢測(cè)試劑盒等。

然而這類直接快速提取試劑盒在DNA純度，分析靈敏度等方面要遜色于傳統(tǒng)的核酸提取方法。轉(zhuǎn)基因直擴(kuò)試劑盒能夠檢測(cè)大部分研磨后的轉(zhuǎn)基因作物種子和葉片樣品，但是對(duì)于含油脂較多的油菜等樣品，其分析性能需要進(jìn)一步提高。

5 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(nucleic acid isothermal amplification)是能在某一特定的溫度下擴(kuò)增特定的DNA或者RNA的一類分子生物學(xué)技術(shù)的總稱。與PCR技術(shù)相比，核酸等溫?cái)U(kuò)增對(duì)儀器的要求大大簡(jiǎn)化，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，更能滿足快速簡(jiǎn)便檢測(cè)的需求。

核酸等溫?cái)U(kuò)增可分為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)，依賴于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)，單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SPIA)，依賴于解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(HAD)，鏈替代擴(kuò)增技術(shù)(SDA)，快速等溫檢測(cè)放大技術(shù)(RIDA)，切刻內(nèi)切酶核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(NEMA)。

應(yīng)用較為廣泛的是LAMP技術(shù)[28-31]。該技術(shù)的基本原理是利用2對(duì)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，使反應(yīng)中在模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，從而保證引物可以在等溫條件下順利與模板結(jié)合，并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)熒光定量PCR儀或者利用核酸擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀反應(yīng)用濁度儀進(jìn)行檢測(cè)。

LAMP核酸擴(kuò)增在等溫條件下進(jìn)行，不需要預(yù)先的雙鏈DNA熱變性、溫度循環(huán)，同時(shí)使用4種特異性引物，產(chǎn)物檢測(cè)用肉眼即可判定，因此具有操作簡(jiǎn)單、快速高效、特異性高、靈敏度高等特點(diǎn)。

LAMP技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地被用于核酸分析，包括病原菌監(jiān)測(cè)、基因型分析和轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。最近，Shen等建立了1種快速可視化檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻和棉花中Cry1A基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法。該LAMP分析在能夠識(shí)別Cry1A基因序列的6個(gè)區(qū)域的4種特異性引物的存在，在65 ℃恒溫條件下，1 h內(nèi)即可以完成擴(kuò)增。該方法的靈敏度可以達(dá)到0.01%，比傳統(tǒng)的PCR方法提高了10倍[32]。

Shao等設(shè)計(jì)了1種基于LAMP技術(shù)的毛細(xì)管陣列平臺(tái)，可簡(jiǎn)單、快速、可視化地同時(shí)檢測(cè)多組分轉(zhuǎn)基因靶基因。在所開(kāi)發(fā)的微陣列中，LAMP引物被預(yù)先固定在毛細(xì)管內(nèi)壁。LAMP反應(yīng)混合物裝載至微陣列后能夠自行分離到每根毛細(xì)管中，繼而平行發(fā)生等溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可以在手持UV裝置的照射下進(jìn)行可視化檢測(cè)。該方法已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)4種常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因特異轉(zhuǎn)化元件和5種不同轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)，具有較為廣闊的應(yīng)用前景[33]。

值得注意的是LAMP是一種鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，要求合適長(zhǎng)度的靶基因序列，當(dāng)靶序列長(zhǎng)度大于500 bp時(shí)較難擴(kuò)增，故不能進(jìn)行長(zhǎng)鏈DNA的擴(kuò)增。該方法靈敏度較高，但是容易污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。LAMP技術(shù)需要多種特異性引物，這些引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜。

6 結(jié)論與展望

目前常用的轉(zhuǎn)基因作物快速檢測(cè)方法是基于外源蛋白或者外源基因檢測(cè)的分析方法?；诘鞍踪|(zhì)的分析方法無(wú)需較為繁瑣的樣品前處理和較為昂貴的檢測(cè)儀器，尤其是免清洗的免疫層析試紙條技術(shù)，能夠顯著縮短分析時(shí)間，非常適合轉(zhuǎn)基因作物的田間地頭的快速篩查。但是對(duì)于不表達(dá)外源蛋白的一些外源基因，如CaMV35s、NOS等轉(zhuǎn)化元件，傳統(tǒng)的蛋白快速檢測(cè)試紙條無(wú)法完成有效檢測(cè)，需要構(gòu)建基于核酸分析的快速檢測(cè)方法，對(duì)目前已有的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)快速檢測(cè)方法做有效補(bǔ)充，從而構(gòu)建完整的轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)體系，以有效支撐轉(zhuǎn)基因相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和管理。

在轉(zhuǎn)基因PCR分析中，需要繁瑣耗時(shí)的核酸提取步驟，同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)高度依賴較昂貴的熒光檢測(cè)儀器或者較復(fù)雜的電泳檢測(cè)技術(shù)，這些方面顯著限制了PCR方法的現(xiàn)場(chǎng)快速簡(jiǎn)便檢測(cè)。近年來(lái)發(fā)展的基因組DNA直接提取法，可以在幾分鐘內(nèi)一步完成轉(zhuǎn)基因作物粉末樣品中DNA的提取，大大縮短核酸的提取時(shí)間，但是其分析適用性有待進(jìn)一步提高。另一項(xiàng)技術(shù)LAMP技術(shù)對(duì)儀器要求不高且結(jié)果可視，但是對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求很高。

隨著轉(zhuǎn)基因作物品系的不斷增加，現(xiàn)有的常規(guī)檢測(cè)方法已不能滿足靈敏、快速、定量及高通量的要求，從而對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。如何將各種已有的檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立高效、快速、簡(jiǎn)便及低成本的檢測(cè)方法，將成為今后轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)技術(shù)研究的發(fā)展趨勢(shì)。近年來(lái)興起的轉(zhuǎn)基因生物傳感器檢測(cè)，有望實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因高度自動(dòng)化、微型化和集成化檢測(cè)；同時(shí)，具有大規(guī)模、高通量、高靈敏等優(yōu)勢(shì)的質(zhì)譜技術(shù)有望解決轉(zhuǎn)基因蛋白準(zhǔn)確定量比較的難題，這些方法是轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)技術(shù)今后發(fā)展的方向。以具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)基因新品系和帶有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物為研究對(duì)象，探索免疫層析試紙條同時(shí)檢測(cè)多種轉(zhuǎn)基因成分的方法和條件，實(shí)現(xiàn)高通量轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的目的，提高檢測(cè)效率，是現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)技術(shù)亟待解決的重點(diǎn)技術(shù)問(wèn)題。

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