牡蠣內(nèi)臟多糖抗氧化活性及對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的影響作用

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(大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

多糖廣泛存在于動物、植物及微生物中,是構(gòu)成生命體的基本物質(zhì)。目前國內(nèi)外已從多種海洋動物體中提取到多糖成分,海洋動物多糖具有廣泛的生物活性。相比來源于陸生植物多糖及化學合成的多糖,海洋動物多糖具有毒副作用小、藥物效果較好的優(yōu)點[1]。朱森君[2]從單環(huán)刺螠內(nèi)臟中提取到一種具有抗氧化活性的多糖。黃璐[3]從鮑魚性腺中分離得到一種具有調(diào)控BMP-2活性的多糖。Shi等[4]從牡蠣中分離得到一種保肝多糖。曲敏等[5]從大鯢體中得到一種具有保肝效果的低聚糖肽。

牡蠣是全球最大養(yǎng)殖貝類,也是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖貝類之一。牡蠣的功效作用主要體現(xiàn)在增強免疫力、降血糖、抗氧化等方面,臨床上使用牡蠣治療慢性中耳炎、子宮肌瘤、失眠等癥狀具有較好的療效[6]。牡蠣中含有大量的多糖,牡蠣多糖在抗腫瘤、抗凝血、抗疲勞和增強免疫力等方面都具有較好的生物活性。王俊[7]提取牡蠣多糖具有增強小鼠免疫和抗腫瘤能力。馬衛(wèi)衛(wèi)[8]發(fā)現(xiàn)牡蠣多糖能增強小鼠胃腸組織的消化能力。胡婷[9]提取了一種具有降血脂、抗凝血的牡蠣多糖。而牡蠣內(nèi)臟約占整個牡蠣的40%,其含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及碳水化合物,但大部分被丟棄,造成了極大的資源浪費[10]。目前對牡蠣內(nèi)臟的研究報道較少,本文利用廢棄的牡蠣內(nèi)臟制備得到牡蠣內(nèi)臟多糖(CGOP),以DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基和FRAP還原能力作為抗氧化模型,評價其抗氧化活性,并研究了CGOP對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用,以期為牡蠣內(nèi)臟的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 大連長興水產(chǎn)市場,取其內(nèi)臟備用;SPF級雄性昆明小鼠(體重18～22 g) 大連醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(遼)2008-0002];聯(lián)苯雙脂滴丸(批號160701) 北京協(xié)和藥廠;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白質(zhì)測定試劑盒 南京建成生物工程公司;DPPH、ABTS 美國Sigma公司;胰蛋白酶(potency ≥2500 units/mg) 上海麥克林公司;其他試劑 為分析純。

660-IR紅外光譜儀 美國Agilent公司;MuLTiSJAN MK3酶標儀、Microcl 17R離心機 美國Thermo公司;DMLLLED型倒置顯微鏡 德國Leica公司;UV-754紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣內(nèi)臟多糖(CGOP)的制備 牡蠣內(nèi)臟多糖參考文獻[11]方法提取。牡蠣內(nèi)臟加蒸餾水勻漿,勻漿液用5%冰醋酸調(diào)整pH至8.0,加入1%胰蛋白酶粉末在45 ℃水浴中酶解4 h,酶解結(jié)束后100 ℃水浴滅酶10 min,酶解液離心(9000 r/min 10 min)得上清液,上清液加入3倍體積的95%乙醇過夜,離心(9000 r/min,10 min)得沉淀,真空冷凍干燥得到牡蠣內(nèi)臟多糖。

1.2.2 總糖含量的測定及紅外光譜(IR)分析 CGOP總糖含量的測定方法采用苯酚硫酸法[12]。取配制合適濃度的CGOP溶液,加入0.5 mL 6%苯酚溶液,混勻后加入2.5 mL 濃硫酸,振蕩后靜置30 min,以葡萄糖為標準品,蒸餾水為空白對照,490 nm波長處測定吸光值,根據(jù)標準曲線(y=0.0085x+0.0583,R2=0.9994),得到CGOP總糖含量,公式如下:

式中,C為標準曲線所得的糖濃度(μg/mL);V為樣品溶液總體積(mL);M為CGOP的質(zhì)量(g)。

紅外光譜分析:將CGOP與KBr混合研磨,壓片后在4000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描檢測,以KBr為掃描背景。

1.2.3 體外抗氧化實驗

1.2.3.1 DPPH自由基清除 清除DPPH自由基的能力采用文獻[13]報道的方法稍加改動進行計算。取不同濃度的樣品溶液2 mL分別加入DPPH·乙醇溶液2 mL于試管中,混合搖勻,于室溫黑暗的環(huán)境中靜置30 min,在波長517 nm處測定吸光值,以無水乙醇溶液做空白,調(diào)零。DPPH清除率的計算公式如下:

DPPH·清除率(%)=1-(Ai-Aj)/Ac×100

式中,Ac：未加入樣品時DPPH的吸光值;Aj：未加入DPPH時樣品的吸光值;Ai：樣品和DPPH混合反應后的吸光值。

1.2.3.2 羥基自由基清除 清除羥基自由基的能力參照文獻[14]報道的方法。取不同濃度的樣品溶液2 mL,分別加入9 mmol/L的FeSO41 mL,9 mmol/L的水楊酸-乙醇1 mL,加入8.8 mmol/L的雙氧水1 mL啟動反應,37 ℃下反應30 min,以蒸餾水為空白,在510 nm下測吸光值,考慮到樣品本身的吸光值,取9 mmol/L的FeSO41 mL,9 mmol/L的水楊酸-乙醇1 mL,以及不同濃度的樣品溶液2 mL作為本底吸收。OH清除率的計算公式如下:

·OH清除率(%)=1-(Ax-Axo)/Ao×100

式中,Ao：空白對照吸光值;Ax：加入樣品溶液吸光值;Axo：未加雙氧水的樣品溶液吸光值。

1.2.3.3 ABTS自由基清除 清除ABTS+·測定采用文獻[15]報道的方法。加入7.4 mmol/L的ABTS儲液,與2.6 mmol/L的K2S2O8于黑暗室溫反應12 h,再用PBS pH7.4稀釋到波長734 nm處吸光值為0.70±0.02,在反應體系中,于試管中加入0.2 mL不同濃度的樣品或參比溶液(pH7.4 PBS),再加入0.8 mL的ABTS反應溶液,振蕩搖勻,室溫下靜置6 min,在波長734 nm下測吸光值。ABTS自由基清除率公式如下:

ABTS自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100

式中,A1：加入樣品溶液吸光值;A0：對照溶液吸光值。

1.2.3.4 FRAP還原能力 還原能力的測定采用文獻[16]報道的方法。吸取1 mL不同濃度的樣品在試管中,分別加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6),混合均勻,50 ℃水浴20 min,冷卻后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液,充分反應后離心(3000 r/min 10 min)取上清液2.5 mL,加入0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液,10 min后在波長700 nm下測吸光值。還原能力的計算公式如下:

還原能力=A1-A2

式中,A1：加入樣品溶液吸光值;A2：蒸餾水代替0.1%三氯化鐵溶液的吸光值。

圖2 CGOP抗氧化能力的測定Fig.2 Determination of antioxidant activities of CGOP注:a. DPPH自由基清除能力;b. 羥基自由基清除能力;c. ABTS自由基清除能力;d. FRAP還原能力。

1.2.4 四氯化碳致小鼠急性肝損傷模型的建立 將60只SPF級雄性昆明小鼠隨機分成正常組、模型組、聯(lián)苯雙脂(200 mg/(kg·d))陽性對照組、牡蠣內(nèi)臟多糖低濃度(200 mg/(kg·d))、中濃度(400 mg/(kg·d))、高濃度(800 mg/(kg·d))劑量組,每組10只,各組每天灌胃一次(0.2 mL),正常組和陽性對照組給予同體積的生理鹽水,連續(xù)灌胃兩周,于末次給藥2 h后,正常組按10 μL/g腹腔注射植物油,其余各組均腹腔注射10 μL/g含0.2% CCl4植物油溶液,禁食不禁水,20 h后摘眼球取血,離心(4 ℃ 3000 r/min 10 min)得上層血清備用。處死小鼠取肝臟,肝左葉組織稱取0.3 g,用生理鹽水制成10%勻漿液,離心(4 ℃ 4500 r/min 10 min)得上清液備用。肝右葉組織稱取0.3 g,用10%中性福爾馬林溶液進行固定,石蠟包埋切片。蘇木精-伊紅(HE)染色,在顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)[17]。

1.2.5 生化指標檢測 試劑盒測定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性,測定小鼠肝組織勻漿液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGOP總糖含量及其紅外光譜(IR)

圖1 牡蠣內(nèi)臟多糖CGOP紅外光譜Fig.1 IR spectra of CGOP

2.2 CGOP抗氧化實驗

由圖2a可知,CGOP對DPPH自由基具有較好的清除效果,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。在濃度為20 mg/mL時,CGOP對DPPH自由基清除率能達到95.65%。由圖2b可知,CGOP在低濃度時,對羥基自由基沒有明顯的清除作用。當CGOP濃度達到1 mg/mL時,隨著濃度的增加,羥基自由基清除率逐漸提高,在濃度為16 mg/mL時,清除率為99.41%。由圖2c可知,CGOP在低濃度時對ABTS自由基基本沒有清除作用,但隨著濃度上升,清除率也逐漸上升,當CGOP濃度達到20 mg/mL時,清除率為96.65%。由圖2d可知,隨著CGOP濃度的增加,FRAP還原能力逐漸上升,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

由上可知,CGOP具有一定程度的抗氧化效果。研究發(fā)現(xiàn),多糖的抗氧化活性與其分子量大小、硫酸根含量及其連接位置等多方面有關(guān)[20]。CGOP清除4種自由基效果較好,推測可能是由于氨基己糖含量較高,因為酰胺基和酚羥基可以提升多糖的抗氧化性[21]。

2.3 CGOP對CCl4致小鼠急性肝損傷生化指標

表1 CGOP對CCl4致肝損傷小鼠的影響Table 1 Effects of CGOP on induced liver damage in mice

注：*p<0.01;#p<0.05與模型組相比。(n=10)。

CGOP對CCl4致小鼠急性肝損傷生化指標結(jié)果如表1所示,模型組各項指標均顯著區(qū)別于正常組(p<0.05),表明建模成功。與模型組相比,灌胃CGOP高劑量組(800 mg/(kg·d))的小鼠血清ALT和AST指標都顯著降低(p<0.05),說明高劑量組的CGOP可顯著抑制由CCl4導致的血清ALT、AST活性的升高。模型組小鼠的MDA含量比正常組顯著上升(p<0.05),而CGOP高劑量組MDA含量顯著低于模型組(p<0. 05),說明灌胃CGOP可以降低小鼠肝組織中MDA含量。CGOP中、高劑量組SOD活性與模型組相比顯著上升(p<0.01),說明灌胃CGOP也可提高肝損傷小鼠肝組織中SOD活性。

CCl4致小鼠肝損傷原理是CCl4進入肝組織細胞代謝,產(chǎn)生大量的自由基,從而破壞肝組織細胞。ALT和AST是肝功能的主要指標,當肝組織受損時,ALT、AST都會進入血液中,導致血清中ALT、AST活性升高[22]。同時肝損傷也會增加肝組織中SOD的消耗,導致其含量下降,并伴隨著MDA的產(chǎn)生,MDA含量上升[23]。實驗結(jié)果說明適當劑量的CGOP對CCl4致小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用。

2.4 CGOP對CCl4致小鼠急性肝損傷肝組織學

正常組小鼠肝組織細胞排列規(guī)則,細胞正常。CCl4模型組肝細胞排列紊亂,有明顯的炎癥、變性及壞死,細胞核不同程度的萎縮。CGOP低、中、高劑量組的肝細胞較模型組明顯恢復正常,排列整齊,說明小鼠接觸CCl4時,CGOP能改善小鼠肝組織細胞狀態(tài),減輕CCl4對肝組織的損傷。

圖3 CGOP對CCl4誘導小鼠急性肝損傷的組織病理影響(HE×400)Fig.3 Effects of CGOP on histopathological changes of hepatic injury by CCl4 in mice(HE×400)注:a.正常組;b.CCl4模型組;c.藥物組; d.CGOP低劑量組;e.CGOP中劑量組;f.CGOP高劑量組。

多糖護肝原理主要為其能有效清除自由基,減少CCl4在肝組織中產(chǎn)生的自由基,防止肝組織病變,例如大鯢低聚糖肽[4]、殼聚糖[24]、牛筋草[25]等。其次是多糖能改善肝損傷小鼠的生化指標,降低小鼠ALT、AST活性和MDA含量,提高SOD活性,達到減輕肝損傷的作用。還有是多糖能促進免疫細胞DNA的合成,使脾細胞和T細胞大量增殖,提高機體免疫能力。

牡蠣內(nèi)臟多糖在體內(nèi)外均表現(xiàn)出較好的抗氧化效果,推測牡蠣內(nèi)臟多糖的抗氧化性可能是通過清除自由基和提高體內(nèi)抗氧化酶活性途徑等方面,來降低或抵御自由基對肝細胞的損傷,從而發(fā)揮抗氧化作用[26-27]。隨著蛋白質(zhì)組學、代謝組學、分子生物學的發(fā)展,在以后的研究中,對其抗氧化及保肝機制進行深入研究,為牡蠣的開發(fā)利用提供參考。

3 結(jié)論

本文用牡蠣內(nèi)臟提取得到CGOP,并研究了其抗氧化能力,對4種氧化模型均表現(xiàn)出一定的抗氧化作用。20 mg/mL CGOP對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基清除率分別為95.7%、96.7%、99.4%,并且具有較好的FRAP還原能力。在CCl4導致小鼠急性肝損傷模型實驗中,CGOP高劑量組(800 mg/kg·d)可顯著降低血清中ALT、AST活性,明顯降低肝組織中MDA含量,并提高肝組織中SOD活性。肝組織形態(tài)學觀察,CGOP劑量組能減輕肝細胞肝損傷狀況。本研究表明,CGOP具有較好的抗氧化能力,并且能有效保護受損的肝組織。研究結(jié)果為更充分利用牡蠣資源提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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