國槐種子蛋白質提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

, ,, ,*,

(1.河西學院農業(yè)與生物技術學院,甘肅張掖 734000; 2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室,甘肅張掖 734000)

國槐(SophorajaponicaL.)為豆科落葉喬木,別名槐樹、中國槐、槐米樹等。國槐資源豐富,其果實、花、葉、樹皮、根及槐膠可入藥[1]?；苯菫槠涔麑?別名槐實、槐子,富含蛋白質、類黃酮、皂苷、維生素類和氨基酸、植物凝集素[2-3]等多種活性成分,槐角具有抗炎、抗?jié)?、抗氧化、抗腫瘤、清熱瀉火、涼血止血、止痛消腫之功效[4-5]。近年來,對于國槐研究主要集中在槐角黃酮、總異黃酮及脂溶性成分的提取及分析[6-9],而對于槐角中蛋白質的研究鮮見報道。大量文獻表明,植物蛋白具有降低膽固醇、抗腫瘤、降血壓和預防心血管疾病等生理功能[10],因此尋求植物蛋白資源具有重要的現(xiàn)實意義。

蛋白質提取的方法有堿溶酸沉法、鹽提法、有機溶劑提取法等[11],其中鹽提法所需設備簡單,無需加入有機溶劑,污染少,成本低,條件溫和,適用于蛋白質提取的工業(yè)化生成[12]。超聲波提取法具有空化效應、粉碎作用,對植物細胞有破壞現(xiàn)象,能使所提取目標物質很好的溶于溶劑中,具有提取時間短、無需加熱、產率高等優(yōu)點[13],廣泛應用于天然活性成分的提取等領域。

響應面法是一種統(tǒng)計學實驗設計方法,目前已被廣泛應用于植物提取過程的優(yōu)化,有效快速地確定最佳因素范圍[14-18],但是采用響應面優(yōu)化超聲輔助提取國槐種子蛋白質的工藝研究尚未見報道,更未見抗氧化方面的研究。本研究以國槐種子為材料,通過單因素實驗和BB設計及響應面分析對超聲輔助鹽法提取國槐種子蛋白質的工藝條件進行優(yōu)化,并研究其對DPPH和ABTS自由基的清除效果,以期為國槐種子蛋白質的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國槐 2015年11月采自河西學院,經張勇教授鑒定為豆科植物國槐SophorajaponicaL.的果實(槐角),分離出中各部位,種子清洗干凈后,陰干,粉碎過60目備用;氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、考馬斯亮藍G-250、磷酸、硫酸銨、95%乙醇等試劑 均為國產分析純;牛血清白蛋白(BSA) 蘇州工業(yè)園區(qū)亞科化學試劑有限公司;2,2-朕氮-雙(3-乙基苯并噻吡咯林-6-磺酸(ABTS)、二苯代苦味肼基(DPPH) 均購自Sigma公司。

KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Sarstorius BT125D電子天平 德國;DR6000型紫外可見分光光度計 美國哈希;CR21GII高速冷凍離心機 日本日立公司;pH510酸度計 安萊立思儀器科技(上海)有限公司;自動移液槍100～5000 μL 百得實驗室(蘇州)儀器有限公司;MiLL ROCK冷凍干燥機 美國。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法 準確稱取國槐種子粉末0.5000 g,按料液比1∶20加入0.2 mol/L磷酸緩沖液,在30 ℃,超聲提取(頻率為40 kHz,超聲功率為250 W)30 min,然后在4 ℃,5000 r/min離心10 min,上清液用緩沖液定容50 mL,用于蛋白質含量測定。

1.2.2 國槐種子蛋白質的測定 國槐種子蛋白質含量采用考馬斯亮藍染色法[19]。標準曲線的制作:分別吸取100 μg/mL牛血清白蛋白0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于試管中,用蒸餾水補足至1 mL,再加入5 mL考馬斯亮藍溶液,混合均勻,5 min后測其吸光度值,建立回歸方程為Y=0.0082X+0.04,Y為吸光度值,X為蛋白質質量(μg),牛血清白蛋白在20～100 μg之間具有良好的線性關系(R2=0.9992)。

蛋白質含量測定:準確吸取0.5 mL稀釋10倍的蛋白質提取液,按照標準曲線的操作,在595 nm處測定吸光度值,根據(jù)回歸方程計算蛋白質的質量,以單位質量材料中蛋白質的含量高低評價提取效果。國槐種子蛋白質提取量按以下公式計算:

式中:Y為提取液中蛋白質質量(μg),V為提取液總體積(mL),M為國槐種子質量(g)。

1.2.3 國槐種子蛋白質提取的單因素實驗 采用1.2.1方法提取國槐種子蛋白質,提取條件為:準確稱取國槐種子粉末0.5000 g 5份,選擇提取溫度30 ℃,超聲時間30 min,料液比1∶20 (g/mL),考察不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)對蛋白質提取效果的影響;準確稱取國槐種子粉末0.5000 g 5份,選擇pH8.0,料液比1∶20 (g/mL),提取溫度30 ℃,考察超聲提取時間(20、30、40、50、60 min)對蛋白質提取效果的影響;準確稱取國槐種子粉末0.5000 g 5份,選擇pH8.0,提取溫度30 ℃,超聲提取時間30 min,考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)對蛋白質提取效果的影響;準確稱取國槐種子粉末0.5000 g 5份,選擇提取溫度30 ℃,超聲提取時間30 min,料液比1∶30 (g/mL),在pH8.0的緩沖液中加入NaCl使終濃度為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L,考察NaCl濃度對蛋白質提取效果的影響。

1.2.4 響應面法提取國槐種子蛋白質工藝研究 在上述單因素實驗的基礎上,對緩沖液pH、超聲時間、料液比、NaCl濃度4個因素進行Box-Behnken實驗設計,進行響應面分析,優(yōu)化工藝條件。實驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken experiment design

1.2.5 工藝的驗證 對優(yōu)化工藝進行5次重復驗證,考察工藝的可靠性，并比較超聲與未超聲時,國槐種子蛋白提取的效果。

1.2.6 蛋白質的初步純化 根據(jù)優(yōu)化的條件提取國槐種子蛋白,取100 mL的蛋白質提取液,加入硫酸銨使飽和度為70%(邊加邊磁力攪拌至硫酸銨溶解),置于冰箱過夜,在4 ℃,5000 r/min離心20 min,棄上清。沉淀溶于0.2 mol/L磷酸緩沖液中進行透析,每6 h換一次透析液,透析至用0.1 moL/L的BaCl2溶液檢測至無白色沉淀為止,用聚乙二醇進行吸水濃縮,濃縮液在溫度-40～-47 ℃下冷凍干燥,得到國槐種子純化蛋白。稱取一定的蛋白用磷酸緩沖液溶解,采用1.2.2的方法測定蛋白質質量濃度為1902 μg/mL,并稀釋200、150、100、50倍使蛋白質質量濃度為9.51、12.68、19.02、38.04 μg/mL,用做抗氧化實驗。

1.2.7 國槐種子蛋白質抗氧化性的研究

1.2.7.1 國槐種子蛋白質對DPPH自由基的清除作用 對DPPH自由基的清除作用參照文獻[20],并稍作修改,在試管中分別加入不同質量濃度的蛋白質溶液2 mL、然后加入2 mL的DPPH乙醇溶液,混合,避光靜置30 min,在517 nm波長下測吸光度Ai;以相應體積的緩沖液代替樣液作空白對照在517 nm波長下測吸光度A0,同時測定2 mL待測液與2 mL 95%乙醇在517 nm波長下的吸光度值(Aj)作為樣品空白,DPPH自由基清除率按以下公式計算。

式中:A0-不加樣品的吸光值,Ai-樣品的吸光值,Aj-樣品的本底吸光值。

1.2.7.2 國槐種子蛋白質對ABTS自由基的清除作用 對ABTS自由基的清除作用參照文獻[21],并稍作修改,分別加入不同濃度國槐種子蛋白質提取液2 mL于試管中,然后加入2 mL的ABTS,混合,避光靜置6 min,在734 nm波長下測吸光度Ai;以相應體積的緩沖液代替樣液作空白對照在734 nm波長下測吸光度A0,同時測定2 mL待測液與2 mL蒸餾水在734 nm波長下的吸光度值(Aj),ABTS自由基清除率按以下公式計算。

式中:A0-不加樣品的吸光值,Ai-樣品的吸光值,Aj-樣品的本底吸光值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,通過Origin 8.0與Design-Expert 8.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

圖1 pH對國槐種子蛋白質提取量的影響Fig.1 Effect of pH on extraction yield of Sophora japonica protein

2.1.1 pH對國槐種子蛋白質提取量的影響 由圖1可以看出,pH對國槐種子蛋白質提取量的影響比較明顯,隨著pH的增大,國槐種子蛋白質提取量也隨著增大,尤其在pH5.0～8.0之間,蛋白質提取量從41.75 mg/g增加到96.75 mg/g,但繼續(xù)增大pH,提取量增大不明顯,反而呈現(xiàn)下降的趨勢。這是因為堿性條件會打破蛋白質分子間的部分氫鍵[17],從而促使淀粉與蛋白質的分離,大大提高了蛋白質的提取量。但是,過于堿性的環(huán)境下可能會使蛋白質發(fā)生變性或者水解,進一步影響到蛋白質的提取量,因此,提取國槐種子蛋白質的緩沖液pH應該控制在pH8.0左右。

2.1.2 超聲時間對國槐種子蛋白質提取量的影響 由圖2可以看出,超聲時間在達到30 min時,國槐種子蛋白質提取量達到最高水平,其后隨著時間的延長,蛋白質的提取量下降,但下降幅度不大,在30～60 min的范圍內,提取量從96.89 mg/g下降到89.63 mg/g,下降了7.26%。分析原因,在超聲波作用下,導致分子振動加快,摩擦增加蛋白質的溶解作用,從而有利于提取。但是提取時間過長可能導致蛋白質變性與水解[17],同時提取時間過長會加大生產成本,故選擇超聲提取時間為30 min比較適宜。

圖2 超聲時間對國槐種子蛋白質提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of Sophora japonica protein

2.1.3 料液比對國槐種子蛋白質提取量的影響 圖3反映了料液比對國槐種子蛋白質提取量的影響,隨著料液比的增大,國槐種子蛋白質的提取量不斷增大,當料液比為1∶30時,蛋白質的提取量達到最大值,而后蛋白質提取量緩慢下降。如果料液比過小,提取體系的黏度過大,物料擴散速度慢,不利于蛋白質的溶出,使提取不完全。且過大的料液比不利于蛋白質后續(xù)的分離純化,料液比以1∶30 (g/mL)為宜。

圖3 料液比對國槐種子蛋白質提取量的影響Fig.3 Effect of the solid-liquid rate on extraction yield of Sophora japonica protein

2.1.4 NaCl濃度對國槐種子蛋白質提取量的影響 由圖4可以看出NaCl的添加大大提高了蛋白質的提取量。隨著NaCl濃度的增加,蛋白質的提取量呈上升趨勢,但濃度達到0.8 mol/L時,蛋白質提取量最大,而后隨濃度增大緩慢下降。這是因為低濃度的鹽溶液能夠增加蛋白質分子表面的電荷,增加其水中溶解度,而隨著NaCl濃度繼續(xù)增加,蛋白質提取量呈下降趨勢,可能是由于高濃度的鹽溶液反而會破壞蛋白質表面的水化膜和電荷[22],且NaCl濃度過大會產生鹽析作用,從而導致提取量下降。因此,選擇NaCl濃度為0.8 mol/L較為適宜。

圖4 NaCl濃度對國槐種子蛋白質提取量的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on extraction yield of Sophora japonica protein

2.2 響應面法優(yōu)化國槐種子蛋白質提取工藝參數(shù)

2.2.1 模型方程的建立與顯著性檢驗 在單因素實驗的基礎上,按照Box-Behnken實驗設計方案進行4因素3水平實驗,實驗結果見表2。

表2 響應面實驗分析方案及結果Table 2 Program and experimental results of RSA

將表2數(shù)據(jù)利用Design-Expert軟件進行方差分析,通過對pH(A)、提取時間(B)、料液比(C)、NaCl濃度(D)進行多元回歸擬合,獲得國槐種子蛋白質對編碼自變量pH、提取時間、料液比、NaCl濃度的回歸方程:

Y=138.0615+4.745A-1.19533B+4.469583C+1.524417D-0.6975AB+2.54175AC+1.05625AD-1.043BC+0.5575BD+4.3065CD-10.6567A2-6.86224B2-8.84512C2-5.19037D2。

方差分析顯著性檢驗見表3,從表3可以看出,該模型F=16.20,p<0.01,表明此回歸模型是極顯著的。pH與料液比的一次項、料液比與NaCl濃度的交互項、pH、超聲時間、料液比以及NaCl濃度的二次項對國槐種子蛋白質提取影響極顯著(p<0.01),其它項影響不顯著(p>0.05)。失擬項F=5.51,p=0.0572>0.05,復相關系數(shù)為0.9418,說明94.18%的蛋白質的變化可由此模型解釋,表明方程的擬合度較好,因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行預測和分析。變異系數(shù)的值為2.27,變異系數(shù)值越小,實驗的可信度和精密度越高。由回歸方程的各項方差分析結果表明,一次項和二次項均有顯著性因素,表明選取的四因素對國槐種子蛋白質提取的影響不是簡單的線性關系,平方項對響應值也有很大影響。由槐角種子蛋白質提取量的回歸方程可知,各因素系數(shù)的絕對值大小反應了其對響應值的影響程度,絕對值大影響程度就越大[23],因為本方程的二次項系數(shù)是均為負值,說明回歸方程所對應的響應面圖形拋物面開口向下,有極大值,可以進行優(yōu)化分析[17]。

各因素的F值大小可以反映因素對實驗指標的重要性,F值越大表明對實驗指標的影響越大。由表3可知,F(A)=33.44,F(B)=2.12,F(C)=29.67,F(D)=3.45,且F(A)>F(C)>F(D)>F(B),即各因素對國槐種子蛋白質提取量的影響順序為:pH>料液比>NaCl濃度>超聲時間。

2.2.2 國槐種子蛋白質提取的響應面分析 利用Design-Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,所得回歸方程的響應面和等高線圖,該圖組可直觀地反映各因素及其交互作用對蛋白質提取量的影響。響應曲面坡度的陡峭程度越大,說明隨著影響因素的變化,對響應值的影響程度越大。而等高線的形狀及疏密程度也可以反映兩因素間交互作用的強弱及因素影響的大小,橢圓形表示兩因素間交互作用較強,圓形則相反[24]。具體結果及分析見圖5(a～f)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

注：**為差異極顯著(p<0.01);*為差異顯著(p<0.05)。

由圖5(a)可知,當料液比與NaCl濃度一定時,隨著超聲時間的增大,蛋白質提取量先增大后降低,但變化趨勢比較平緩,而pH的變化坡度陡峭,且提取液pH軸向等高線密集,等高線呈圓形,說明兩交互作用不顯著,從曲面圖的陡峭及等高線的疏密程度表明pH比超聲時間對響應值的峰值影響較大。pH在8附近,超聲時間在30 ℃左右,響應值最大。

圖5(b)表明,當超聲時間與NaCl濃度一定時,隨著pH的增大,蛋白質提取量先升高后降低,變化趨勢陡峭;隨著料液比的增大,蛋白質提取量先增高后降低,變化趨勢相對于pH平緩,等高線呈圓形,兩交互作用不顯著。說明pH比料液比對于國槐種子蛋白質的提取影響較大。

圖5(c)表明,當超聲時間與料液比固定時,隨著pH與NaCl濃度的增大,蛋白質提取量呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢,但pH較NaCl濃度變化的曲面曲度較大,且等高線呈圓形,表面兩交互作用不顯著,pH的變化對蛋白質提取量的影響較大。

圖5(d～e)反映超聲時間與料液比、NaCl濃度對蛋白質提取量交互影響的響應面圖,從圖可以看出,隨著超聲時間和NaCl濃度的增大,蛋白質提取量先增大后降低,但變化趨勢比較平緩,隨著料液比的增大,蛋白質提取量急劇增加,而后緩慢降低,說明料液比的變化對響應值影響較大。超聲時間與NaCl濃度、料液比對蛋白質提取量的等高線呈圓形,說明兩者交互作用不顯著。

圖5(f)表明,當超聲時間與pH固定在零水平時,反映料液比與NaCl濃度對蛋白質提取量交互影響的響應面圖,可以看出,蛋白質提取量隨料液比和NaCl濃度增大而增大而后降低,并發(fā)現(xiàn)料液比軸向等高線變化密集,NaCl濃度軸向等高線的變化相對稀疏,等高線呈橢圓形,說明料液比與NaCl濃度交互作用顯著。分析可知料液比對響應值的峰值較NaCl濃度影響較大。

因此,綜合表3及圖5(a～f)可以得出,pH、超聲時間、料液比、NaCl濃度對蛋白質提取量影響的大小為pH>料液比>NaCl濃度>超聲時間。

圖5 各因素交互作用對蛋白質提取量影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction conditions on protein extraction yield

2.3 驗證實驗

經Design-Expert 8.0軟件對回歸方程進行分析,得到該模型優(yōu)化最佳參數(shù)為:pH8.15緩沖液包含0.82 mol/L NaCl、超聲時間29 min、料液比1∶31.5、預測值為139.36 mg/g。考慮到實際的操作性,將實驗條件修正為:pH8.2緩沖液包含0.82 mol/L NaCl,超聲時間29 min,料液比1∶31,對此工藝進行5次重復驗證,測得蛋白質含量的平均值為139.25 mg/g,相對標準偏差為0.37%,模型預測值139.36 mg/g,實測值與預測值非常接近,說明該方程與實際情況擬合很好,充分驗證了所建模型的正確性,證實了該模型的有效性。同時也說明了響應面分析法適用于超聲輔助提取國槐種子蛋白質參數(shù)的優(yōu)化。在上述參數(shù)條件下比較了超聲與未超聲時國槐種子蛋白提取的效果,在超聲與未超聲條件下蛋白質的提取量分別為139.38和88.75 mg/g,說明超聲輔助提取大大提高了國槐種子蛋白質的提取量。

2.4 國槐種子蛋白的抗氧化效果研究

DPPH自由基是一種人工合成的、穩(wěn)定的以氮為中心的質子有機自由基,ABTS是一種水溶性的自由基引發(fā)劑,由于DPPH法和ABTS法操作簡單,重復性好,不需要特殊的檢測設備,通過反應體系顏色的改變來評價試樣的抗氧化性,因此許多研究者將DPPH法和ABTS法用作抗氧化劑的抗氧化能力評價方法[25]。如圖6、圖7所示,隨著蛋白質質量濃度的增大,對DPPH自由基和ABTS自由基清除率均呈現(xiàn)上升趨勢,當?shù)鞍踪|質量濃度為38.04 μg/mL,對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率分別為29.44%和90.82%,而且國槐種子蛋白質對ABTS自由基的清除作用大于對DPPH自由基的清除作用。

圖6 國槐種子蛋白對DPPH自由基的清除作用Fig.6 The scavenging effect of Sophora japonica seeds protein on DPPH radical

圖7 槐種子蛋白對ABTS自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effect of Sophora japonica seeds protein protein on ABTS radical

3 結論與討論

本研究在單因素實驗的基礎上,采用BB設計及響應面分析優(yōu)化了超聲輔助鹽溶法提取國槐種子蛋白質的工藝,得到國槐種子蛋白質提取的最優(yōu)條件,即pH8.2緩沖液包含0.82 mol/L NaCl、超聲時間29 min、料液比1∶31,在這種條件下,蛋白質最大提取量為139.25 mg/g,高于單因素實驗結果。國槐種子蛋白的研究相對較少,但是產地、采樣時間的不同,其結果差異較大,李婷等[26]研究了國槐不同采樣時間種子萌發(fā)及代謝生理的影響,發(fā)現(xiàn)國槐種子11月采收后可溶性蛋白為144.40 mg/g,趙墾田等[3]對國槐種子化學成分進行了分析,種子中蛋白質占主要成分,粗蛋白在50%左右,由此說明國槐種子含有大量的蛋白質,有開發(fā)利用前景。

研究表明,蛋白質的抗氧化活性與巰基含量和蛋白酶及組成蛋白質的氨基酸種類、氨基酸的序列及蛋白質的疏水性有關[27],本研究結果顯示,國槐種子蛋白質在一定的質量濃度范圍內對DPPH自由基和ABTS自由基有清除作用,但對ABTS自由基清除效果較好,濃度為38.04 μg/mL時其清除率為90.82%,表現(xiàn)出良好的抗氧化活性,該抗氧化活性是否與蛋白質的巰基及氨基酸組成等因素有關,需要更一步研究。

[1]毛秀紅,荀守華,孫居文,等.我國槐屬植物育種及種質資源開發(fā)利用進展[J]. 植物生理學報,2015,51(4):399-406.

[2]Davis BD,Brodbelt JS. Determination of the glycosylation site of flavonoid monoglucosides by metal complexation and tandem mass spectrometry[J]. Journal of the American Society for Mass,2004,15(9):1287-1299.

[3]趙墾田,韓淑芹,崔玉蘭.等.國槐(Sophorajaponica)種子成分分析[J].植物研究,1999,19(3):281-285.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(第一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:355.

[5]陳明珠,申艷艷,趙越,等.槐角黃酮的體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(4):94-96.

[6]叢艷波,劉寧,張永忠. 微波輔助提取槐角總異黃酮的研究[J].精細化工,2010,27(11):1083-1085.

[7]冉曉燕,胡德禹,薛偉.槐角中總黃酮的提取工藝研究[J].貴州教育學院學報,2009,20(6):22-24.

[8]周金娥,陳聰穎,謝一凡,等.槐角中脂溶性化學成分的研究[J].上海交通大學學報,2006,26(11):1245-1248.

[9]王景華,王亞琳,樓鳳昌.槐樹種子的化學成分研究[J].中國藥科大學學報,2001,32(6):471-473.

[10]陳貴堂,趙霖.植物蛋白的營養(yǎng)生理功能及開發(fā)利用[J].食品工業(yè)科技,2004,25(9):137-140.

[11]Albert Sickmann,Wilma Dormeyer,Stefanie Wortelkamp,et al.Identification of proteins from human cerebrospinal fluid. separated by two-dimensional polyacrylamide gelelectrophoresis[J]. Electrophoresis,2000,21(13):2721-2728.

[12]初眾,邢春影,嚴善春.洋蟲成蟲蛋白質化學提取方法的比較[J].東北林業(yè)大學學報,2007,35(4):50-52.

[13]羅琥捷,楊宜婷,黃壽根,等. 超聲提取法與索氏提取法提取陳皮黃酮類有效成分的分析比較[J].中藥材,2016,39(2):371-374.

[14]余小翠,劉高峰.響應面分析法在中藥提取和制備工藝中的應用[J].中藥材,2010,33(10):1651-1655.

[15]張艷,李永哲. 響應面法及其在藥學領域中的應用[J].吉林化工學院學報,2012,29(7):20-25.

[16]李莉,張賽,何強,等. 響應面法在實驗設計與優(yōu)化中的應用[J]. 實驗室研究與探索,2015,34(8):41-45.

[17]張秀云,李丹丹,馬艷芳.響應面法優(yōu)化白果蛋白質提取工藝[J].食品工業(yè)科技,2016,37(4):299-302.

[18 Tang De-Song,Tian Ying-Juan,He Yuan-Zhe,et al. Optimisation of ultrasonic-assisted protein extraction from brewer’s spent grain[J]. Czech J Food Sci,2010,28(1):9-17.

[19]王林嵩.生物化學實驗技術[M].北京:科學出版社,2010.

[20]liu Xiao Li,Cui Chun,Zhao Mou Ming,et al.Identification of phenolics in the fruit of emblica(PhyllanthusemblicaL.)and their antioxidant activities[J].Food Chemistry,2008,109(4):905-915.

[21]Zhang Sheng,Li Xiang Zhou,Wu Zhi Ping,et al. Antioxidant activity of polysaccharide from camellia cake against ABTS and DPPH free radicals[J]. Advanced Materials Research,2012,550-553(7):1545-1549.

[22]饒勝其,臧祥玉,濮瑜雯,等.響應面實驗優(yōu)化廣昌白蓮蛋白提取工藝及其酶解多肽抗氧化活性[J].食品科學,2015,36(24):63-69.

[23]宋海燕,何文輝,彭自然,等.響應面法優(yōu)化鹿角菜中巖藻多糖的提取工藝[J].海洋科學,2016,40(4):73-80.

[24]單麗芳,曹蕾,楊紅梅,等. Box-Behnken 響應面法優(yōu)選參芪復方顆粒的水提工藝[J]. 天然產物研究與開發(fā),2016,28(4):568-574.

[25]Vít Marecek,Alexandr Mikyska,David Hampel,et al. ABTS and DPPH methods as a tool for studying antioxidant capacity of spring barley and malt[J]. Journal of Cereal Science,2017,73:40-45.

[26]李婷,彭祚登. 不同采種期對國槐種子萌發(fā)及生理代謝的影響[J].東北林業(yè)大學學報,2016,44(3):33-36.

[27]FANG Yunzhong,YANG Sheng,WU Guoyao. Free radicals antioxidants and nutrition[J]. Nutrition,2002,18(10):872-879.