嗜酸乳桿菌zrx02的plnD基因克隆及生物信息學(xué)分析

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(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003; 2.云南商務(wù)信息工程學(xué)校,云南昆明 650051)

群體感應(yīng)(Quorum sensing,QS)也稱(chēng)為通訊機(jī)制,是一種與群體密度相關(guān)的機(jī)制,通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng),細(xì)菌可以控制自身或其他細(xì)菌的細(xì)胞群體密度和調(diào)控特定基因的表達(dá)[1],如葡萄球菌致病基因的表達(dá)、乳酸菌細(xì)菌素的產(chǎn)生、芽孢桿菌生物膜的形成等[2-4]。目前已有研究者發(fā)現(xiàn),細(xì)菌群體感應(yīng)與細(xì)菌素的產(chǎn)生機(jī)制有密切關(guān)系,細(xì)菌素的產(chǎn)生依賴(lài)于自誘導(dǎo)肽,只有自誘導(dǎo)肽達(dá)到一定的濃度細(xì)菌素才會(huì)產(chǎn)生,這個(gè)濃度閾值依賴(lài)于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞的數(shù)量,也就是依賴(lài)群體感應(yīng)系統(tǒng)[5-7]。

乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素分為兩大類(lèi),Ⅰ類(lèi)稱(chēng)為羊毛硫細(xì)菌素(Lantibiotics)家族,Ⅱ類(lèi)稱(chēng)為非羊毛硫細(xì)菌素家族,目前研究表明嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素大多屬于Ⅱ類(lèi)細(xì)菌素[8],該類(lèi)細(xì)菌素分子量大多數(shù)小于10 kDa,由天然氨基酸組成,轉(zhuǎn)錄后不修飾,屬于穩(wěn)定的疏水肽,并由QS系統(tǒng)調(diào)控。研究者在產(chǎn)細(xì)菌素的基因中證實(shí)了pln基因座有5個(gè)可誘導(dǎo)操縱子,分別是plnABCD、plnGHSTUVW、plnJKLR、plnEFI和plnMNOP[9],其中plnABCD編碼產(chǎn)物有自誘導(dǎo)肽plnA,跨膜組氨酸蛋白激酶plnB和兩種高度同源的反應(yīng)調(diào)節(jié)器plnC和plnD[10-13],隨著細(xì)胞的生長(zhǎng),自誘導(dǎo)肽會(huì)在細(xì)胞膜外積累,當(dāng)積累到一定濃度會(huì)激活細(xì)胞膜上的plnB蛋白并與其結(jié)合,在保留的組氨酸殘基處自磷酸化,磷酸基團(tuán)被運(yùn)輸給plnC和plnD蛋白,被磷酸化后的調(diào)節(jié)因子特異性結(jié)合到目標(biāo)啟動(dòng)子,兩種反應(yīng)調(diào)節(jié)器開(kāi)始起作用,其中plnC激活目標(biāo)蛋白的表達(dá),plnD抑制目標(biāo)蛋白的表達(dá),起到調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)作用,使自誘導(dǎo)肽和細(xì)菌素產(chǎn)生[13]。

表1 相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequence of related genes

乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素可以廣泛地抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和部分真菌,目前已經(jīng)有乳酸菌素應(yīng)用于食品的防腐處理,乳酸菌能產(chǎn)生多種細(xì)菌素,Indira從日常廢水分離出乳酸菌,并利用該菌分離純化出多種細(xì)菌素[14],Ge從副干酪乳桿菌HD1-7中純化到一種新的細(xì)菌素并用于食品防腐[15];Ekblad分析了兩種多肽類(lèi)細(xì)菌素的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)[16]。乳酸菌產(chǎn)生多種細(xì)菌素主要依賴(lài)于存在的群體效應(yīng),副干酪乳桿菌克隆到prcA基因,該基因是副干酪乳桿菌群體效應(yīng)相關(guān)基因-自誘導(dǎo)肽編碼基因,負(fù)責(zé)細(xì)菌素生成的調(diào)控[17];從杏鮑菇和海帶分離的乳酸菌中克隆到Lcn972A基因和Nisin-like基因[18-19]。pln基因座的DNA 片段組成5～6個(gè)操縱子,基因座的保守部分有plnABCD調(diào)控操縱子,編碼一個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng),這一感應(yīng)系統(tǒng)在pln基因座表達(dá)所有相關(guān)蛋白時(shí)是必須的,不用菌株的pln操縱子和群體效應(yīng)對(duì)細(xì)菌素的合成都有影響,但是關(guān)于這些操縱子的生物功能研究還比較缺乏,其中的plnD作為反應(yīng)調(diào)節(jié)器起著重要的作用,研究更少。

嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬,是一類(lèi)無(wú)芽孢革蘭氏陽(yáng)性桿菌,菌體以單個(gè)、成雙或者短鏈狀排列,形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)桿狀,同型發(fā)酵乳酸,不能液化明膠,能夠釋放乙酸、乳酸和一些抑制有害菌生長(zhǎng)的細(xì)菌素,但是對(duì)于該菌的群體效應(yīng)研究較少。所有pln啟動(dòng)子區(qū)域都包含一段保守的直接重復(fù)序列,這些保守的直接重復(fù)序列是plnD結(jié)合序列[20-21],是研究群體感應(yīng)的重要內(nèi)容,但是目前對(duì)調(diào)節(jié)因子plnD相關(guān)研究比較缺乏,因此本研究對(duì)嗜酸乳桿菌zrx02中plnD基因進(jìn)行克隆,并用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因的理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析,為嗜酸乳桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)生物調(diào)控細(xì)菌素合成機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌 由本實(shí)驗(yàn)室從泡菜中自行分離保存,編號(hào)為zrx02;大腸桿菌DH5α上海生工生物有限公司;pMD-19T質(zhì)粒 大連TAKARA生物有限公司;MRS液體培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、Mg2SO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42.0 g、硫酸錳0.25 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1000 mL,微調(diào)pH6.5)用于嗜酸乳桿菌zrx02的培養(yǎng);LB培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母浸膏5 g/L,NaCl 10 g/L,pH7.0;固體培養(yǎng)基:固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L)用于大腸桿菌DH5α的培養(yǎng);Taq DNA polymerase、氨芐青霉素 大連TAKARA生物有限公司;細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽屜試劑盒 上海生工生物有限公司。

101-3ABS電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市用光明醫(yī)療儀器廠;RP1000910059可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司;SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺(tái) 蘇州凈化儀器有限公司;SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器制作有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;95-2磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器有限公司;JA2003電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司;Powerpac通用電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司;Tanon 4200凝膠成像儀 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)plnD基因的PCR合成引物參考文獻(xiàn)[11],擴(kuò)增plnD基因引物序列如表1所示,產(chǎn)物大小預(yù)測(cè)值為414 bp,16S基因引物序列如表1所示,設(shè)計(jì)的引物在上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2plnD基因克隆 將保藏的嗜酸乳桿菌株劃線(xiàn)于MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h,接種于MRS培養(yǎng)液中,37 ℃振蕩培養(yǎng)(200 r/min)18 h,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取該菌的基因組DNA作為PCR的模板,對(duì)細(xì)菌素相關(guān)基因進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為25 μL,包括DNA模板1 μL,10×PCR 緩沖液2.5 μL,dNTP 2 μL,Mg2+1.5 μL,上游引物plnD-F 1 μL,下游引物plnD-R 1 μL,rTaq 0.125 μL,ddH2O 16 μL。plnD基因的PCR擴(kuò)增條件為:預(yù)熱溫度95 ℃,時(shí)間5 min;解鏈溫度95 ℃,時(shí)間30 s;退火溫度53 ℃,時(shí)間30 s;延伸溫度72 ℃,時(shí)間90 s循環(huán)30次;溫度72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠,1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳,在130 V電壓下,跑30 min后,取出膠在EB染色池中染色15 min,然后通過(guò)紫外凝膠熒光掃描儀檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD-19T克隆載體上,轉(zhuǎn)入E.coliDH-5α感受態(tài)細(xì)胞。在氨芐抗生素的LB平板上涂布培養(yǎng),挑單菌落PCR鑒定,將獲得的陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖2 嗜酸乳桿菌zrx02系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Lactobacillus acidophilus zrx02

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站利用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用ORF Finder(Open Reading Frame Finder)對(duì)嗜酸乳桿菌zrx02細(xì)菌素合成必需基因片段進(jìn)行閱讀框分析,轉(zhuǎn)化成氨基酸序列。對(duì)基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行分析(http://web.expasy.org/protparam),跨膜螺旋信號(hào)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/),結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(www.ebi.ac.uk/interPro/search/sequence-search),蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_sopm.html),三級(jí)結(jié)構(gòu)建模(https://swissmodel.expasy.org/)。

2 結(jié)果與討論

2.1 16S rRNA鑒定

通過(guò)對(duì)菌株的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增,得到了1493 bp的基因片段(圖1),與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的序列進(jìn)行比對(duì),利用軟件Mega5.1按照Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)該菌與LactobacillusacidophilusIDCC3302(GenBank登錄號(hào)KP325412.1)同源性最高,達(dá)到99%,推測(cè)該菌為嗜酸乳桿菌,命名為L(zhǎng)actobacillusacidophiluszrx02。

圖1 嗜酸乳桿菌zrx02的16S基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of 16S gene for Lactobacillus acidophilus zrx02

2.2 嗜酸乳桿菌zrx02基因組DNA及plnD基因克隆

利用細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取嗜酸乳桿菌zrx02的基因組DNA(圖3a),結(jié)果顯示該菌基因組DNA長(zhǎng)度約為19000 bp,以嗜酸乳桿菌zrx02的基因組DNA為模板,利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得plnD基因條帶(圖3b),測(cè)序結(jié)果顯示長(zhǎng)度為355 bp。

圖3 嗜酸乳桿菌zrx02的基因組DNA及plnD合成基因的PCR擴(kuò)增Fig.3 Total genomic DNA of Lactobacillus acidophilus and PCR amplification of gene for plnD

2.3 plnD基因氨基酸序列分析

圖4 plnD基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of plnD gene

利用NCBI的ORF Finder工具對(duì)嗜酸乳桿菌zrx02的plnD合成基因片段進(jìn)行閱讀框分析,預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列。結(jié)果顯示該基因序列包含一個(gè)全長(zhǎng)為279 bp的開(kāi)放閱讀框,起始密碼子ATG,終止密碼子TAG。預(yù)測(cè)的氨基酸序列為MLKDQSADL ITQRIIKDINVVQNELKKTNSQRKDVFNYKLGTRYFSL ALDDVILLSTSKLRPGSVQLHAINKVAEFPGNLNALEE KYPQFYS,將氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。結(jié)果表明從嗜酸乳桿菌zrx02擴(kuò)增的plnD基因的氨基酸序列與Lactobacillusplantarumstrain(WP 016526896.1)plnD gene的同源性為100%,表明plnD基因的氨基酸序列在同屬中具有較高的保守性,親緣關(guān)系較近。

2.4 plnD基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)

在線(xiàn)軟件蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,plnD編碼產(chǎn)物共有92個(gè)氨基酸,相對(duì)分子量10.54 ku,理論等電點(diǎn)9.26,帶負(fù)電的殘基數(shù)(Asp+Glu)為10個(gè),帶正電荷的殘基數(shù)(Arg+Lys)為13個(gè),分子式為C474H764N128O141S1,原子數(shù)1508,脂肪系數(shù)100.65,總平均疏水指數(shù)-0.397,不穩(wěn)定系數(shù)25.83%,說(shuō)明該蛋白較穩(wěn)定,出現(xiàn)頻率較高的氨基酸殘基為L(zhǎng)eu(13.0%),Lys(9.8%)和Asn(7.6%),不含有Pyl和Sec。預(yù)測(cè)在N端的序列是Met,哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞(體外)半衰期為30 h,酵母細(xì)胞(體內(nèi))半衰期為20 h,大腸桿菌細(xì)胞(體內(nèi))半衰期為10 h。分子量與引物所在文獻(xiàn)的報(bào)道和其它文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果有所差異,可能是因?yàn)椴煌锓N相關(guān)基因存在著分子量差異,并表現(xiàn)出多態(tài)性,可利用異源表達(dá)來(lái)驗(yàn)證該菌所產(chǎn)細(xì)菌素的分子量[22-25]。

2.5 plnD基因編碼產(chǎn)物氨基酸跨膜螺旋信號(hào)分析

跨膜蛋白由跨越脂質(zhì)膜的片段(通常是螺旋)以及膜外連接這些片斷的卷曲區(qū)域組成的?？缒さ钠瓮休^高比例的疏水殘基,長(zhǎng)度常常在20個(gè)殘基以上,這種相對(duì)較長(zhǎng)的疏水殘基片斷在可溶性球蛋白中很少見(jiàn),因而可以依靠疏水殘基片斷來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)?？缒ぢ菪强梢愿鶕?jù)序列數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)特性之一。plnD基因編碼產(chǎn)物氨基酸跨膜螺旋信號(hào)分析結(jié)果如圖5所示,所有氨基酸位于細(xì)胞內(nèi)的概率在20%左右,位于細(xì)胞外的概率在80%左右。

圖5 plnD基因編碼產(chǎn)物的氨基酸跨膜螺旋數(shù)據(jù)分析結(jié)果Fig.5 Results of amino acid transmembrane heices of the encoded product of plnD gene

由在線(xiàn)分析結(jié)果可知,plnD基因編碼產(chǎn)物氨基酸跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)是0.03689,前60個(gè)氨基酸殘基數(shù)是0.03661,跨膜蛋白判定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)顯示,如果預(yù)測(cè)蛋白前60個(gè)氨基酸中跨膜螺旋中有數(shù)個(gè)氨基酸殘基數(shù),預(yù)測(cè)跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)大于18,則氨基酸很有可能存在跨膜序列,并且蛋白的N端可能存在信號(hào)肽[15]。由此可以說(shuō)明嗜酸乳桿菌zrx02細(xì)菌素相關(guān)基因plnD編碼產(chǎn)物不具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu),而且N端不存在信號(hào)肽。

2.6 plnD基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

結(jié)構(gòu)域是指在不同的分子中重復(fù)出現(xiàn)、有高度相似的序列片段,在線(xiàn)軟件分析結(jié)果顯示plnD基因編碼產(chǎn)物沒(méi)有預(yù)測(cè)的蛋白家族,但有LytTR DNA-binding 結(jié)構(gòu)域,位于第36～92個(gè)氨基酸之間(圖6)。

圖6 plnD基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.6 Predict of amino acid domain of the encoded product of plnD gene

2.7 plnD基因編碼產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果如圖7所示。plnD基因編碼產(chǎn)物中存在α螺旋、伸展鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲,其中α螺旋所占比例較高。plnD基因編碼產(chǎn)物中有47個(gè)氨基酸形成α螺旋,占所有氨基酸的51.09%,16個(gè)氨基酸形成伸展鏈,占所有氨基酸的17.39%,21個(gè)氨基酸形成無(wú)規(guī)則卷曲,占所有氨基酸的22.83%。

圖7 plnD基因編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Analysis of secondary structure of the encoded product of plnD gene注:長(zhǎng)豎條紋代表α螺旋;中豎條紋代表伸展鏈; 短豎條紋代表β轉(zhuǎn)角;超短豎條紋代表無(wú)規(guī)則卷曲。

將氨基酸序列進(jìn)行同源建模,得到plnD基因編碼產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖,如圖8所示。plnD蛋白模型與Streptococcuspneumoniae中的ComE同源性最高(22.22%)。

圖8 plnD基因編碼產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 Tertiary structure of the encoded product of plnD gene

3 結(jié)論

本研究利用細(xì)菌素plnD基因的特異性引物對(duì)嗜酸乳桿菌zrx02基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)該菌基因組中存在相關(guān)合成基因,通過(guò)生物信息學(xué)分析plnD基因編碼產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)該編碼產(chǎn)物共有92個(gè)氨基酸,相對(duì)分子量10.54 ku。依據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)需小于40才是穩(wěn)定蛋白的標(biāo)準(zhǔn),可判斷plnD編碼蛋白是穩(wěn)定蛋白,這與軟件分析的結(jié)果一致,另外嗜酸乳桿菌zrx02細(xì)菌素合成相關(guān)基因(plnD)編碼產(chǎn)物不具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu),而且N端不存在信號(hào)肽,說(shuō)明產(chǎn)物可以大量的分泌到胞外,可直接用發(fā)酵液做防腐處理。因此,本研究利用基因克隆篩選細(xì)菌素的方法有一定的應(yīng)用價(jià)值,不僅為食品防腐提供材料,而且為細(xì)菌素合成機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

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