一株許氏平鲉(Sebastes schlegelii)腸道乳酸菌的分離鑒定及特性分析*

王騰騰 韋秀梅 常 城 韓慧宗 姜海濱①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室煙臺(tái) 264006)

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類不運(yùn)動(dòng)、無芽孢、能利用碳水化合物發(fā)酵并產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱(張剛, 2007)。因其具有綠色安全、無毒副作用、無殘留的特點(diǎn), 在海水魚養(yǎng)殖業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。章蔚(2012)發(fā)現(xiàn)用分離獲得的明串珠菌屬乳酸菌投喂黑鯛幼魚, 可以提高幼魚腸道菌群多樣性、促進(jìn)幼體腸道的生長(zhǎng)發(fā)育; Gatesoupe等(1994)以乳桿菌強(qiáng)化的活體輪蟲作為大菱鲆幼體的食物, 證實(shí)了乳酸菌的使用可以提高幼魚成活率; 王福強(qiáng)(2005)用鼠李糖乳桿菌P15投喂牙鲆稚魚, 達(dá)到了降低水中和牙鲆消化道中弧菌數(shù)量、提高成活率、促進(jìn)生長(zhǎng)的效果。以上研究證明, 乳酸菌可以促進(jìn)海水魚類生長(zhǎng)、提高成活率, 在海水魚養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用有望減少抗生素使用, 促進(jìn)海水魚養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展。

許氏平 鲉 (Sebastes schlegelii)是我國(guó)黃渤海區(qū)域習(xí)見的魚類之一, 因其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速, 已成為北方沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖和人工放流的重要經(jīng)濟(jì)魚類。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大, 病害問題日益突出, 許氏平鲉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展受到制約。從許氏平鲉腸道中分離乳酸菌等益生菌, 對(duì)于研制有效的微生態(tài)添加劑, 提 高許氏平 鲉 抗病能力具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)許氏平 鲉 的研究主要集中在繁殖生物學(xué)(馮東岳等, 2003)、發(fā)育生物學(xué)(楊艷萍等,2012; 藺玉珍等, 2014; 馬麗曼, 2014)等方面, 對(duì)其腸道微生物的研究非常有限, 腸道乳酸菌分離鑒定和特性分析的研究更未見報(bào)道。本研究首次從野生許氏平 鲉 腸道內(nèi)分離獲得了一株乳酸菌, 采用 16S rDNA基因序列分析法對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定, 并對(duì)其生長(zhǎng)特性、抑菌特性及動(dòng)物安全性進(jìn)行了研究, 旨在為篩選能夠提高許氏平 鲉 免疫力和抗病能力、促進(jìn)其生長(zhǎng)的乳酸菌提供理論依據(jù), 從而為研發(fā)適用于許氏平 鲉 養(yǎng)殖業(yè)的微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

海捕野生許氏平 鲉 體長(zhǎng) 17.51cm, 購(gòu)于煙臺(tái)市遲家農(nóng)貿(mào)市場(chǎng), 用 于乳酸菌的分離。健康許氏平 鲉 體長(zhǎng)9.87±1.73cm, 由煙臺(tái)泰華海珍品有限公司提供, 用于乳酸菌的安全性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)菌分離純化

用 70%的酒精擦拭魚體腹部表面, 在無菌條件下解剖, 剪下中腸段; 去除腸道內(nèi)容物, 以無菌生理鹽水沖洗2次后, 用解剖刀刮取腸道內(nèi)壁的黏液, 加入到無菌生理鹽水中, 渦旋振蕩搖勻后均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基。30°C無氧條件下培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落,再重復(fù)平板劃線分離出單菌落。挑取單菌落 30°C擴(kuò)繁后保種于甘油中。

1.3 細(xì)菌鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)觀察及生理生化特征鑒定 將保種的菌株接種于 MRS培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)、顏色等。挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色和脫脂乳試管凝固試驗(yàn)。將培養(yǎng)到指數(shù)期的菌株經(jīng)戊二醛(2.5%)固定、磷酸緩沖液(pH7.4)漂洗、酒精梯度脫水和叔丁醇重懸后制作玻片, 通過掃描電鏡觀察其形態(tài)特征; 以梅里埃 API 50CHL試劑條進(jìn)行生理生化測(cè)試, 對(duì)分離獲得的細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2 細(xì)菌 16S rDNA基因序列分析 采用 16S rDNA基因序列分析的方法對(duì)初步鑒定的細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定。擴(kuò)增引物序列為: 8F-5′AGAGTTTGATCCTG GCTCAG3′, 1492R-5′GGCTACCTTGTTACGACTT3′。反應(yīng)體系為 50μL, 其中包括: 正、反向引物(10mmol/L)各 2μL, 2μL 分離菌菌液, 0.4μL Taq 酶,5μL 10×PCR Buffer (Mg2+), 4μL dNTPs, 34.6μL ddH2O。序列擴(kuò)增反應(yīng)條件為: 94°C 5min; 94°C 30s,55°C 30s, 72°C 2min, 30 個(gè)循環(huán); 72°C 10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司北京測(cè)序?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中所收集的相關(guān)種屬的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析。

1.4 生長(zhǎng)特性分析

1.4.1 pH對(duì)生長(zhǎng)的影響 取100μL培養(yǎng)至指數(shù)期的菌懸液接種于終pH值分別為3.2、4.2、4.9、5.7、6.5、7.2、8.4、8.8、9.1、9.4、9.6、10.3 的 MRS 培養(yǎng)基中, 30°C培養(yǎng)24h后檢測(cè)600nm的光密度, 并測(cè)定培養(yǎng)基的最終pH值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個(gè)平行。采用SPSS軟件包單因素方差分析法(one-way ANOVA)中的 Duncan多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 再利用Origin 8.0軟件作圖。

1.4.2 溫度對(duì)生長(zhǎng)的影響 取 100μL培養(yǎng)至指數(shù)期的菌懸液接種到MRS培養(yǎng)基中, 分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45和 50°C 下培養(yǎng) 24h, 檢測(cè) 600nm的光密度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個(gè)平行。數(shù)據(jù)分析和作圖方法同上。

1.4.3 NaCl含量對(duì)生長(zhǎng)的影響 取100μL培養(yǎng)至指數(shù)期的菌懸液接種于NaCl含量(w/v%)為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10的MRS培養(yǎng)基中, 30°C培養(yǎng)24h后檢測(cè)600nm的光密度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個(gè)平行。數(shù)據(jù)分析和作圖方法同上。

1.5 抑菌作用分析

采用平板擴(kuò)散法檢測(cè)乳酸菌產(chǎn)物的抑菌作用。選取金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、遲鈍愛德華氏菌、鰻弧菌、假交替單胞菌和哈維氏弧菌作為指示菌。指示菌培養(yǎng)至指數(shù)期后加入到未冷凝的固體培養(yǎng)基中, 待培養(yǎng)基凝固后制作直徑 5mm的加樣孔。乳酸菌置于37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)12h至指數(shù)期后, 10000r/min離心5min, 取200μL上清液加入指示菌平板的加樣孔中, 對(duì)照組加等量的MRS液體培養(yǎng)基, 30°C培養(yǎng)24—48h后觀察和測(cè)量抑菌圈大小。每種指示菌設(shè)三個(gè)平行。

1.6 安全性檢測(cè)

安全性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)參照El-Rhman等(2009)、Aly等(2008)的 方法設(shè)計(jì)。選取健康許氏平 鲉 40尾, 分4組,每組 10尾, 暫養(yǎng)于 70L玻璃缸內(nèi), 水溫 15±1°C。日換水1次, 每次換水1/5; 連續(xù)充氣, 不投喂食物, 及時(shí)清理糞便; 暫養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。乳酸菌在 37°C,200r/min條件下振蕩培養(yǎng) 12h至指數(shù)期后,10000r/min離心5min, 用0.65%的無菌生理鹽水重懸至108CFU/mL。

第1 組 許氏平 鲉 每尾肌肉注射100μL菌懸液, 第2組每尾肌肉注射100μL0.65%無菌生理鹽水為對(duì)照;第3組每尾腹腔注射1000μL菌懸液, 第4組每尾腹腔注射相同劑量的0.65%無菌生理鹽水為對(duì)照。每組設(shè)三個(gè)平行。注射后連續(xù)觀察 10天, 統(tǒng)計(jì)各組許氏平 鲉 的生長(zhǎng)和死亡狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的鑒定結(jié)果

2.1.1 初步鑒定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)共分離純化出35株腸道菌, 通過細(xì)菌生化測(cè)試實(shí)驗(yàn), 選取革蘭氏染色呈陽性, 脫脂乳試管凝固試驗(yàn)中牛乳出現(xiàn)凝固、無氣泡、呈酸性現(xiàn)象的一株細(xì)菌初步鑒定為乳酸菌, 命名為YH1。該菌株的菌落呈白色、圓形、表面光滑、邊緣圓潤(rùn)。掃描電鏡結(jié)果如圖 1所示, 乳酸菌 YH1細(xì)胞形狀規(guī)則, 呈桿狀, 無鞭毛, 表面較光滑, 長(zhǎng)度約為1.87μm、寬度約為0.69μm。菌株YH1的生理生化特征描述如表1所示。

2.1.2 16S rDNA序列分析結(jié)果 采用PCR儀擴(kuò)增細(xì)菌YH1的16S rDNA基因獲得大小為1456bp的片段, 將該序列提交到GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù), 登陸號(hào)為KX440974.1。16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果顯示:菌株 YH1與食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)CH2(CP012873.1)的相識(shí)度為 99%, 與食竇魏斯氏菌JCM7777(AB911503.1)的相識(shí)度為 99%, 與食竇魏斯氏菌 CAG13(AB572036.1)的相識(shí)度為 99%, 屬魏斯氏菌屬成員; 結(jié)合其形態(tài)學(xué)和生理生化特征, 確定菌株YH1為食竇魏斯氏菌YH1。

2.2 YH1的生長(zhǎng)特性研究結(jié)果

圖1 YH1的掃描電鏡圖(標(biāo)尺=500nm)Fig.1 Scanning electron micrograph of Strain YH1

表1 YH1的生理生化特征鑒定結(jié)果表Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strainYH1

2.2.1 不同pH值下 YH1的生長(zhǎng)情況 食竇魏斯氏菌YH1在初始pH為4.2—8.8的培養(yǎng)基下均能生長(zhǎng),但生長(zhǎng)情況存在明顯差異。在初始pH為4.2—8.4的培養(yǎng)基中, 隨著初始 pH的升高, 培養(yǎng)液在實(shí)驗(yàn)終止與初始時(shí)的 OD600差值不斷增加, 在初始 pH為7.2—8.4處達(dá)到最大, 說明在該pH范圍下YH1生長(zhǎng)情況最好; 在 8.4—8.8內(nèi), 培養(yǎng)液的 OD600差值有所下降。當(dāng)培養(yǎng)基初始 pH過低(pH=3.2)或者過高(pH=9.1、9.4、9.6、10.3), YH1幾乎不生長(zhǎng)(圖 2)。不同pH條件下YH1生長(zhǎng)24h后, 培養(yǎng)基pH的變化結(jié)果如圖3所示, 初始pH4.9—8.8的培養(yǎng)液發(fā)酵24h后的 pH均發(fā)生了明顯變化, 且隨著初始 pH的不斷增大, 24h后的pH降幅越大; 初始pH過低(pH=3.2)或者過高(pH=9.1、9.4、9.6、10.3), 培養(yǎng)基的 pH無變化(圖 3)。

圖2 不同pH條件下YH1的生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth of YH1 in various pH注: 所有數(shù)據(jù)按照平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示。不同字母表示兩組間YH1生長(zhǎng)情況差異顯著(P＜0.05)。

圖3 不同pH條件下YH1生長(zhǎng)24h培養(yǎng)基pH的變化Fig.3 The variations of medium pH after 24h culture under different initial pH

2.2.2 不同溫度下YH1的生長(zhǎng)情況 食竇魏斯氏菌 YH1在 15—45°C 均能生長(zhǎng), 其中最適生長(zhǎng)溫度35°C, 且各溫度下YH1的生長(zhǎng)情況存在顯著差異。在15—35°C, 隨著培養(yǎng)溫度的升高, YH1培養(yǎng)液在實(shí)驗(yàn)終止與初始時(shí)的OD600差值逐漸增大, 在35°C時(shí)達(dá)到最大值, 為0.979。當(dāng)培養(yǎng)溫度大于35°C時(shí), YH1培養(yǎng)液在實(shí)驗(yàn)終止與初始時(shí)的OD600差值逐漸降低。當(dāng)培養(yǎng)溫度過低(T=5°C、10°C)或溫度過高(50°C)時(shí),YH1培養(yǎng)液在實(shí)驗(yàn)終止與初始時(shí)的 OD600差值最低,YH1幾乎不生長(zhǎng)(圖4)。

2.2.3 不同NaCl含量下YH1的生長(zhǎng)情況 食竇魏斯氏菌YH1在NaCl含量(w/v%)為0—10的MRS培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。隨著NaCl含量的升高, YH1培養(yǎng)液在實(shí)驗(yàn)終止與初始時(shí)的OD600差值逐漸降低, 說明向MRS培養(yǎng)基中添加NaCl會(huì)抑制YH1的生長(zhǎng)。不同NaCl含量條件下YH1生長(zhǎng)情況的差異性如圖5所示。

圖4 不同溫度下YH1的生長(zhǎng)情況Fig.4 The growth of YH1 in various temperatures注: 所有數(shù)據(jù)按照平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示。不同字母表示兩組間YH1生長(zhǎng)情況差異顯著(P＜0.05)。

圖5 不同NaCl含量下YH1的生長(zhǎng)情況Fig.5 The growth of YH1 vs. concentration of NaCl注: 所有數(shù)據(jù)按照平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示。不同字母表示兩組間YH1生長(zhǎng)情況差異顯著(P＜0.05)。

2.3 YH1產(chǎn)物的抑菌活性

分析 YH1產(chǎn)物的抑菌活性發(fā)現(xiàn), 該產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、遲鈍愛德華氏菌、鰻弧菌、假交替單胞菌、哈維氏弧菌等指示菌均有抑制作用, 可形成直徑為 11—21mm的抑菌圈(表2)。其中YH1的產(chǎn)物對(duì)假交替單胞菌和鰻弧菌的抑菌效果如圖6所示。YH1的產(chǎn)物具有廣譜抑菌性。。

2.4 YH1對(duì)許氏平鲉的安全性

以108CFU/mL 濃 度向許氏平 鲉 體內(nèi)注射YH1并未引發(fā)魚體發(fā)病或死亡, 表明YH1在108CFU/mL及以下濃度對(duì) 許 氏平 鲉 是相對(duì)安全的(表3)。

表2 YH1產(chǎn)物對(duì)指示菌的抑菌活性Tab.2 Antimicrobial activity of YH1's supernatant on indicatorbacteria

表3 YH1對(duì)許氏平鲉的安全性Tab.3 Safety test on YH1 to S. schlegelii

3 討論

近年來, 對(duì)于鼠李糖乳桿菌(王福強(qiáng), 2005)、明串珠球菌(章蔚, 2012)等常見乳酸菌的研究發(fā)現(xiàn), 乳酸菌可以改善養(yǎng)殖水域環(huán)境、提高養(yǎng)殖魚類免疫力。這些研究為從海水魚類腸道分離的乳酸菌進(jìn)一步應(yīng)用于海水魚類養(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)。魏斯氏菌作為一種不常見乳酸菌, 對(duì)其的研究相對(duì)較少。本研究從野生海捕的許氏平 鲉 腸道內(nèi)分離獲得了一株特征明顯的乳酸菌菌株。通過革蘭氏染色、形態(tài)觀察、脫脂乳試管凝固試驗(yàn)、生理生化指標(biāo)檢測(cè)和16S rDNA基因序列分析, 發(fā)現(xiàn)該株細(xì)菌為魏斯氏菌屬成員, 確定為食竇魏斯氏菌YH1。

pH、溫度和NaCl含量是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的重要因素, 探究細(xì)菌的生長(zhǎng)特性對(duì)掌握其最適培養(yǎng)條件具有重要意義。食竇魏斯氏菌 YH1的生長(zhǎng)特性研究表明, 其最適培養(yǎng)條件為: pH 7.2—8.4、溫度35°C。向MRS培養(yǎng)基中添加 NaCl, YH1的生長(zhǎng)受到抑制, 這一結(jié)果與王福強(qiáng)(2005)對(duì)于鼠李糖乳桿菌P15的研究結(jié)論相同。在探究不同pH值條件下生長(zhǎng)情況的實(shí)驗(yàn)中, 食竇魏斯氏菌YH1在初始pH值為4.6—8.8條件下均能生長(zhǎng), 在7.2—8.4條件下生長(zhǎng)最好, 且通過測(cè)定培養(yǎng)24h后各培養(yǎng)基的酸堿度發(fā)現(xiàn), YH1生長(zhǎng)使培養(yǎng)基的pH值明顯下降, 并趨于4.0。YH1在堿性條件下生長(zhǎng)的過程中產(chǎn)酸降低了培養(yǎng)基的pH值, 形成了有利的生長(zhǎng)環(huán)境, 從而促進(jìn)了自身的生長(zhǎng); 同時(shí)YH1生長(zhǎng)的產(chǎn)物又降低了環(huán)境的 pH值, 形成了良性循環(huán)。因此在不同初始pH環(huán)境下, YH1的生長(zhǎng)情況趨向一致。

乳酸菌通過競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、附著位點(diǎn)或分泌細(xì)菌素等毒素的方式殺死或抑制病原微生物, 有效調(diào)節(jié)魚類胃腸中的菌群平衡, 增強(qiáng)魚體抗感染能力, 提高免疫力和存活率(張艷婷等, 2012)。楊鶯鶯等(2005)以溶藻弧菌和鯊魚弧菌為指示菌探究了乳酸桿菌的抑菌性,結(jié)果表明乳酸桿菌及其代謝物質(zhì)對(duì)弧菌具有協(xié)同抑制作用。本研究結(jié)果顯示, 食竇魏斯氏菌 YH1的產(chǎn)物不僅能抑制溶藻弧菌、副溶血弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、假交替單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌等革蘭氏陰性病原菌的生長(zhǎng), 也對(duì)金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性病原菌的生長(zhǎng)有抑制效果。YH1表現(xiàn)出廣譜抑菌活性, 暗 示其能在許氏平 鲉 抵御多種病原菌的過程中發(fā)揮作用, 作為益生菌添加可能提高許氏平 鲉 對(duì)抗病原菌侵染的能力。乳酸菌YH1的廣譜抑菌作用為其在海水養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供了前提。

乳酸菌的抑菌作用機(jī)理一直都是研究熱點(diǎn)。楊勇(2006)探究了抑制鰻弧菌生長(zhǎng)的乳酸菌產(chǎn)物, 推測(cè)乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)鰻弧菌的抑制作用是由其中的乳酸或乙酸等有機(jī)酸造成的, 而不是乳酸菌素類物質(zhì)。陳營(yíng)等(2002)的研究認(rèn)為乳酸菌的抑菌機(jī)制主要是分解糖類產(chǎn)生乳酸, 降低環(huán)境中的 pH值, 抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。本研究在分析食竇魏斯氏菌YH1在不同pH環(huán)境下的生長(zhǎng)情況時(shí)發(fā)現(xiàn), YH1可顯著降低環(huán)境 pH值, 推測(cè)YH1產(chǎn)酸降低環(huán)境pH值可能是其抑制病原指示菌生長(zhǎng)的方式之一, 但其抑菌機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

益生菌是一類對(duì)機(jī)體健康有益且無致病性的微生物。益生菌的安全性檢測(cè)是其投入生產(chǎn)應(yīng)用前確保其對(duì)機(jī)體無致病性的必要測(cè)試。El-Rhman等(2009)在探究藤黃微球菌和假單胞菌對(duì)尼羅羅非魚生長(zhǎng)性能和健康的促進(jìn)作用前先驗(yàn)證了這兩株細(xì)菌在羅非魚機(jī)體內(nèi)的安全性。呂利群等(2010)在檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌 Sh1的動(dòng)物安全性試驗(yàn)中指出, 腹腔注射1×108CFU/mL的 Shl對(duì)草魚的生長(zhǎng)沒有任何不良影響。Kim 等(2006)將從虹鱒腸道分離出的Carnobacterium maltaromaticum B26菌株和廣布肉桿菌Carnobacterium divergens B33菌株腹腔或肌肉注射魚體或者投喂含二菌株的飼料均無毒性。本研究中動(dòng)物安全性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明, 腹腔或肌肉注射1×108CFU/mL的食竇魏斯氏菌YH1 對(duì)許氏平 鲉 無毒性。本研究為下一步探究食竇魏斯氏菌 YH1對(duì)許氏平 鲉 生長(zhǎng)和免疫的影響提供了理論依據(jù), 為其應(yīng)用于生產(chǎn)提供了可能性。

4 結(jié)論

本研究分析了食竇魏斯氏菌 YH1的生長(zhǎng)條件,證實(shí)了其廣譜抑菌性和動(dòng)物安全性, 顯示了該菌作為有益菌用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的潛力, 為乳酸菌微生態(tài)制劑的開發(fā)及其在許氏平 鲉 養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

馬麗曼, 2014. 許 氏平 鲉 性別相關(guān)基因 Sox3、Sox9和 Dmrt1的研究. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué)博士學(xué)位論文

王福強(qiáng), 2005. 牙鲆腸道益生菌的分離鑒定及其應(yīng)用研究. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文

馮東岳, 2003. 許氏平(鲉)繁殖生物學(xué)及人工養(yǎng)殖技術(shù)的研究.青島: 中國(guó)海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文

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