siRNA干擾Rac1表達(dá)對人晶狀體上皮細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

孫國慶 唐建明

[摘要] 目的 研究Rac1對人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04增殖和遷移能力的影響，探究Rac1在后囊下混濁及囊袋皺縮綜合征發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。 方法 將SRA01/04細(xì)胞分為Mock組和siRac1組，構(gòu)建Rac1相關(guān)siRNA并瞬時轉(zhuǎn)染于siRac1組細(xì)胞中，Western blot檢測Rac1蛋白表達(dá)的變化，CCK檢測細(xì)胞生長周期的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡變化，Transwell檢測Rac1對細(xì)胞遷移能力的影響。 結(jié)果 兩組72 h時吸光度值均高于24 h（P < 0.05），siRac1組48、72 h時吸光度值均低于Mock組（P < 0.05）；與Mock組比較，siRac1組mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯降低，G1期細(xì)胞所占百分率明顯增高，S期細(xì)胞所占百分率明顯降低，穿越基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。F-actin染色結(jié)果顯示，siRac1組細(xì)胞的偽足形成能力較Mock組減弱。 結(jié)論 Rac1可能通過調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞的增殖能力和遷移能力，影響后囊下混濁及囊袋皺縮綜合征的發(fā)生、發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 后囊下混濁；囊袋皺縮綜合征；Rac1；晶狀體；上皮細(xì)胞

[中圖分類號] R776.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（b）-0017-04

[Abstract] Objective To study the effect of Rac1 on the proliferation and migration of human lens epithelial cells SRA01/04， and to explore the role of Rac1 in the development and progression of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome. Methods SRA01/04 cells were divided into mock group and siRac1 group. Rac1-related siRNA was constructed and transiently transfected in siRac1 group cells. Western blot was used to detect the changes of Rac1 protein expression， CCK was used to detect the changes of cell growth cycle， flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis， Transwell was used to detect the effect of Rac1 on cell migration ability. Results The absorbance values of the two groups at 72 hours were higher than those at 24 hours （P < 0.05）， the absorbance values of siRac1 group at 48， 72 hours were lower than those of mock group （P < 0.05）. Compared with mock group， the relative expression of mRNA and protein in siRac1 group decreased significantly， the percentage of G1 phase cells increased significantly， while the percentage of S phase cells decreased significantly， the number of cells passing through the membrane reduced significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05）. F-actin staining showed that the forming ability of pseudopodium in siRac1 group was significantly weaker than that of mock group. Conclusion Rac1 may affect the occurrence and development of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome through adjusting the proliferation and migration of lens epithelial cells.

[Key words] Posterior capsular opacities； Capsular contraction syndrome； Rac1； Lens； Epithelial cells

后囊下混濁（posterior capsular opacities，PCO）和囊袋皺縮綜合征（capsular contraction syndrome，CCS）是白內(nèi)障超聲乳化術(shù)后常見并發(fā)癥，其發(fā)生與發(fā)展均與白內(nèi)障術(shù)后殘留晶狀體上皮細(xì)胞的增殖與遷移有關(guān)[1-2]。Rac1是Rho家族重要成員之一，有促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡的作用[3]。近年來有文獻(xiàn)證實(shí)，Rac1可以促進(jìn)大鼠視網(wǎng)膜新生血管的形成[4]，而且在人翼狀胬肉也有表達(dá)[5]。但Rac1作用于晶狀體上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究較少。我們在人晶狀體上皮細(xì)胞SRA01/04中通過siRNA來干擾Rac1的表達(dá)以觀察其對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，從而驗(yàn)證通過降低Rac1表達(dá)以降低PCO和CCS發(fā)生及進(jìn)展的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 SRA01/04購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫，培養(yǎng)液為添加10%胎牛血清（美國，Gibco）的DMEM培養(yǎng)基（中國，吉諾），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d將處于對數(shù)生長期的SRA01/04細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染空白組（Mock組）和基因沉默組（siRac1組），以5×105個/孔的濃度分別接種于6孔板中，每孔均添加2 mL無抗生素培養(yǎng)基，確定細(xì)胞平鋪均勻。

1.1.2 試劑與耗材 siRNA購自上海吉瑪公司，siRac1正義序列為5′-GGGAUGAUAAAGACACGAUTT-3′，反義序列為5′-AUCGUGUCUUUAUCAUCCCTT-3′；OPTI-MEMI（中國，吉諾）；Lipofectamin 2000（美國，Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將1 OD siRac1加入150 μL DEPC水中，溶解后混合均勻配置成20 nmol/L的siRac1溶液。將5 μL Lipofectamin 2000和5 μL siRac1加入250 μL OPTI-MEMI中孵育20 min后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基已更換為OPTI-MEMI的6孔板中，每孔培養(yǎng)液總體積為2 mL。6 h后更換為完全培養(yǎng)基。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞棄去培養(yǎng)基后胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104個/mL接種于96孔培養(yǎng)板。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，另設(shè)不加細(xì)胞的培養(yǎng)基為本底。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入含10% CCK-8的普通培養(yǎng)基110 μL，37℃下孵育2 h。在Safire熒光酶標(biāo)儀（美國，TECAN）490 nm波長處測量各孔的吸光度值。吸光度值大小表示細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測蛋白相對表達(dá)量 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后抽提細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后各取50 μg總蛋白在SDS-PAGE膠中進(jìn)行凝膠電泳后轉(zhuǎn)印于PVDF膜，經(jīng)Rac1一抗（美國，Abcam）孵育過夜，羊抗鼠二抗（美國，Santa cruz）室溫孵育2 h后HRP發(fā)光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡 細(xì)胞周期檢測：將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞胰酶消化后收集至試管中，經(jīng)PBS洗滌后于70%的冰乙醇中固定置于4℃過夜，次日用PBS反復(fù)洗滌2次，在RNase A濃度為100 μg/mL、PI濃度為5 μg/mL的溶液中室溫避光孵育30 min。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國，BD）檢測。細(xì)胞凋亡檢測：Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞并用PBS洗滌，離心后分別加入300 μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻細(xì)胞后再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育0.5 h后用流式細(xì)胞儀檢測。CellQuest軟件進(jìn)行PCNA表達(dá)分析，確定表達(dá)PCNA細(xì)胞占檢測細(xì)胞的百分比，分析細(xì)胞增殖、周期及遷徙等。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力檢測 24孔Transwell小室進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h胰酶消化后調(diào)整濃度為2.5×106個/mL，各取200 μL置于上室，下室中加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，用棉簽擦去聚碳酸酯膜靠近內(nèi)室一面的細(xì)胞，甲醛室溫固定10 min，結(jié)晶紫染色30 min，清水洗3遍，顯微鏡下觀察細(xì)胞，記數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較Mock組和siRac1組的差異，其中重復(fù)測量設(shè)計(jì)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，各時間點(diǎn)的組間差異比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各組的時間差異兩兩比較，行LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRac1對SRA01/04細(xì)胞增殖能力的影響

重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果顯示，組別、時間以及組別×?xí)r間的交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。進(jìn)一步組內(nèi)兩兩比較結(jié)果顯示，與24 h比較，siRac1組和Mock組72 h時吸光度值均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；組間比較結(jié)果顯示，siRac1組48、72 h時吸光度值均低于Mock組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表1。

2.2 siRac1對SRA01/04細(xì)胞Rac1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與Mock組比較[（86.16±10.21）%、（89.68±7.13）%]，siRac1組mRNA及蛋白相對表達(dá)量[（15.23±4.56）%、（17.63±4.17）%]均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見圖2。

2.3 siRac1對SRA01/04細(xì)胞周期的影響

與Mock組[（46.96±4.90）%]比較，siRac1組G1期細(xì)胞所占百分率[（62.43±5.40）%]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 8.249，P = 0.001）；與Mock組[（41.10±4.70）%]比較，siRac1組S期細(xì)胞所占百分率[（21.07±3.90）%]明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 21.492，P = 0.000）。見圖3。

2.4 siRac1對SRA01/04細(xì)胞遷移能力及細(xì)胞骨架的影響。

siRac1組穿越基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)[（75±6）個]明顯少于Mock組[（135±5）個]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 16.145，P = 0.000）。F-actin染色結(jié)果顯示，siRac1組細(xì)胞的偽足形成能力較Mock組減弱。見圖4。

3 討論

現(xiàn)代白內(nèi)障手術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)將白內(nèi)障手術(shù)推入屈光手術(shù)的范疇。所有可能會影響術(shù)后視覺質(zhì)量的并發(fā)癥都會被每一個術(shù)者極力避免，其中包括PCO和CCS[6-7]。PCO即后發(fā)性白內(nèi)障，是白內(nèi)障摘除術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病原因?yàn)榘變?nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞遷移至后囊膜，進(jìn)而分化為成纖維細(xì)胞[8-9]。

CCS表現(xiàn)為撕囊面積和晶狀體囊袋赤道部直徑縮小、前囊膜混濁、人工晶狀體偏心、傾斜或脫位。CCS發(fā)病率雖不及PCO，但其一旦發(fā)生不良后果將更加嚴(yán)重。CCS發(fā)病原因?yàn)榘變?nèi)障術(shù)后殘存的晶狀體上皮細(xì)胞纖維化，致前囊膜皺縮，嚴(yán)重者可致人工晶體脫位或脫入玻璃體，繼而引發(fā)眼內(nèi)炎[10-12]。

因此PCO與CCS的發(fā)生都與白內(nèi)障術(shù)后晶狀體后囊膜、赤道部和前囊膜下殘余的上皮細(xì)胞增殖、遷移有著直接的關(guān)系。白內(nèi)障手術(shù)醫(yī)生通過控制撕囊大小、前囊膜、后囊膜拋光等手術(shù)技巧，可顯著降低CCS及PCO的發(fā)生率[13-15]。但手術(shù)技巧的提高并不能完全避免PCO及CCS的發(fā)生，尤其是兒童先天性白內(nèi)障[1]。因此，阻斷晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、遷移成為避免PCO及CCS發(fā)生最直接、最根本的方法。

Rho家族蛋白可以通過多種途徑參與和調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、凋亡和細(xì)胞周期的變化。Rac1是Rho家族小GTP酶之一，它在人體各組織中均有表達(dá)，已有文獻(xiàn)證實(shí)其參與腫瘤細(xì)胞侵襲遷移和周期調(diào)節(jié)。Rac1生物功能的發(fā)揮依賴于兩種活性形式間的轉(zhuǎn)換，且其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組、影響細(xì)胞形體極化、促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動與遷移、抑制細(xì)胞凋亡的作用[16-17]。目前Rac1是各個學(xué)科廣泛研究的熱點(diǎn)。齊巖等[18]對Rac1在鼻咽癌組織中的表達(dá)及預(yù)后做了相關(guān)研究。解娜等[19]闡述了Rac1對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。張斌等[20]闡述了Rac1在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。

本研究通過siRNA來干擾SRA01/04中Rac1的表達(dá)，提示Rac1不僅影響晶狀體上皮細(xì)胞的生長水平及增殖能力，還影響其細(xì)胞周期及遷移能力。由于血眼屏障的存在，人晶狀體內(nèi)無血管，白內(nèi)障術(shù)后殘存的晶狀體上皮細(xì)胞直接暴露于房水中，其生長、繁殖營養(yǎng)完全依賴房水。這也使得殘存的晶狀體上皮細(xì)胞所處的細(xì)胞外環(huán)境相對穩(wěn)定，且相對易于體外培養(yǎng)模擬。因此，雖然本研究為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，但其應(yīng)用性及穩(wěn)定性相對可靠。期待后續(xù)可以在動物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行前房內(nèi)注射siRac1阻斷Rac1的表達(dá)，驗(yàn)證其阻止PCO與CCS發(fā)生及發(fā)展的作用。

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（收稿日期：2018-04-20 本文編輯：張瑜杰）