腸道微生物群和免疫反應在艱難梭菌感染中的作用研究進展

趙杏珍（ZHAO Xing-zhen），楊 靖（YANG Jing），2，趙建宏（ZHAO Jian-hong），2

（1河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；2河北省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000）

艱難梭菌是一種革蘭陽性厭氧芽孢桿菌。近年來由于高產(chǎn)毒株027／NAP1／BI型艱難梭菌在歐美地區(qū)的暴發(fā)流行，艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的嚴重程度和發(fā)病率急劇上升［1］。在美國，艱難梭菌已經(jīng)取代耐甲氧西林金黃色葡 萄 球 菌 （methicillin-resistant Staphylococcus aureu，MRSA）成為醫(yī)院感染的首要病原菌，因此其將艱難梭菌的威脅等級定為最高“緊急”級別。CDI的臨床表現(xiàn)可從無癥狀定植到輕度自限性腹瀉或重度假膜性腸炎甚至危及生命。其臨床癥狀的發(fā)生發(fā)展主要取決于兩個方面，一是艱難梭菌的毒力，二是宿主腸道微生物群及免疫反應。毒素是艱難梭菌最主要的毒力因子，包括毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB），兩者均能滅活GTP結合蛋白，引發(fā)一系列反應最終導致腹瀉和腸炎［2－3］。此外，某些特殊型別的菌株如027／NAP1／BI還能產(chǎn)生二元毒素，與CDI的高發(fā)病率和病死率相關［4］。黏附是艱難梭菌另一項重要的毒力因素，參與黏附的物質(zhì)有很多，如艱難梭菌表面蛋白、鞭毛等均可參與細菌黏附過程［5－8］。不管是毒素還是細菌表面成分均可引起免疫反應，如炎性介質(zhì)釋放、免疫效應細胞趨化等。腸道微生物群在CDI過程中也是至關重要的，一旦微生物群平衡被破壞，便可促進腸道內(nèi)艱難梭菌芽孢的萌發(fā)、生長、繁殖、定植、產(chǎn)毒。目前，在中國和其他許多亞洲國家，CDI尚未引發(fā)暴發(fā)流行，但人們對CDI的重視程度不夠，國內(nèi)關于CDI的研究數(shù)據(jù)非常有限。因此，本文就艱難梭菌的致病過程及腸道微生物群和免疫反應在CDI發(fā)生發(fā)展過程中的作用作以綜述。

1 CDI的致病過程

腸道微生物群失衡為CDI創(chuàng)造了有利條件，其致病過程可分為以下步驟：芽孢經(jīng)糞－口途徑進入腸道，繼而萌發(fā)成繁殖體；繁殖體生長繁殖，并定植于腸道；艱難梭菌分泌毒素A和B，個別型別的艱難梭菌還可以產(chǎn)生二元毒素。毒素A和毒素B均為單糖基轉移酶，分別由tcdA和tcdB基因編碼，兩者均可滅活 Rho GTP酶家族中的Rho、Rac及Cdc4，從而破壞細胞骨架及緊密連接，使細胞變圓、破裂、死亡［2］。這一過程可嚴重損傷上皮細胞屏障的完整性，使其通透性增加、液體分泌增多，從而損傷腸道。與此同時，毒素還能誘發(fā)一系列免疫反應。免疫細胞釋放的炎癥介質(zhì)趨化中性粒細胞聚集，進一步損傷腸道，最終導致腹瀉和腸炎［3］。

黏附功能在定植及致病過程中也起著重要作用。介導艱難梭菌和腸道相互作用的主要物質(zhì)是細菌表面蛋白，也叫細胞壁蛋白（cell wall protein，Cwp），包括S層蛋白（S-layer protein，SLP）、黏附素Cwp66和半胱氨酸蛋白酶Cwp84等。SLP是細菌表面最主要的物質(zhì)，能夠在細菌表面緊密排列形成晶體層，SLP又分為低分子量SLP（low-molecular weight S-layer protein，LMW-SLP）和高分子量SLP （high-molecular weight S-layer protein，HMW-SLP）。前者暴露于細菌表面參與黏附過程；后者固定于細胞壁，可結合細胞外基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白Ι、血小板反應蛋白和玻璃體結合蛋白等，促進艱難梭菌結合到人體腸道［6］。半胱氨酸蛋白酶Cwp84同樣位于細菌表面，其N端有蛋白水解位點，C端錨定在細胞壁上。Cwp84能將前體SlpA（S-layer proteinA，SlpA）分解為上述兩種 SLPs。此外，它還能降解細胞外基質(zhì)蛋白，如纖維蛋白、層黏連蛋白和玻璃體結合蛋白，促進細菌擴散［7］。Cwp66蛋白也具有黏附功能，其C端暴露于細菌表面，具有高度變異性和免疫原性，N端錨定于細胞壁，菌種間保守。其他表面蛋白還包括：纖維連接蛋白結合蛋白Fbp68，位于細菌表面，參與細菌黏附于纖維連接蛋白和上皮細胞，不同菌種間保守并有高度免疫原性［6］；熱休克蛋白GroEL是細菌熱休克后釋放到細胞外的一種物質(zhì)，菌種間高度保守，具有細胞黏附作用［8］；膠原蛋白結合蛋白CbpA的N端有膠原結合位點，位于細菌表面［9］；脂蛋白具有高度黏附能力和免疫原性［10］。

此外，艱難梭菌還可分泌一些蛋白促進其擴散，如分泌型鋅金屬蛋白酶能清除宿主體內(nèi)某些蛋白，如IgA抗體、纖維蛋白原及纖維連接蛋白，破壞體內(nèi)纖連蛋白網(wǎng)［11－12］。另外，許多艱難梭菌都具有運動力。艱難梭菌的鞭毛不僅參與定植、黏附和生物膜形成等過程，還具有免疫原性［13］。

2 腸道微生物群在CDI過程中的作用

抗菌藥物暴露、年齡、炎癥性腸病、化學治療、使用質(zhì)子泵抑制劑等都是引發(fā)CDI的危險因素［14］，且這些危險因素均與腸道菌群多態(tài)性及種類的改變有關，提示腸道微生物群在CDI過程中發(fā)揮著重要作用，主要包括兩點：定植抵抗和代謝調(diào)節(jié)。

2.1 腸道微生物群的定植抵抗作用 腸道微生物群可以有效抵抗艱難梭菌定植、擴散。正常小鼠腸道內(nèi)微生物種類高達60種，其中擬桿菌門和厚壁菌門數(shù)量最多。目前，尚未確定真正發(fā)揮定植抵抗作用的特異性菌種。但研究［15］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)克林霉素處理后的小鼠，其腸道微生物群中發(fā)生明顯改變的菌種有腸桿菌科、腸球菌屬、毛螺菌科，提示以上3科／屬菌種可能與定植抵抗相關。腸道微生物群對艱難梭菌的定植抵抗包括直接作用和間接作用。前者指共生菌與艱難梭菌之間的直接作用，如競爭生存空間、營養(yǎng)素或者共生菌分泌細菌素抑制艱難梭菌定植［16-20］。如 Rea等［20］通過 對人體 末 端 結 腸 模型的研究發(fā)現(xiàn)蘇云金菌素CD對艱難梭菌有很好的抑制作用，同時對其他共生菌無影響，提示細菌素可以作為CDI新的治療方法。間接作用指腸道微生物群通過調(diào)節(jié)代謝影響艱難梭菌生長。如腸道內(nèi)一些共生菌可以自由分泌唾液酸酶促使上皮細胞分泌唾液酸入腸道，唾液酸作為共生菌的能量來源被利用。而長期服用抗菌藥物可使腸道內(nèi)共生菌豐度降低，唾液酸等代謝產(chǎn)物增多，從而促進艱難梭菌的生長［16］。以上研究均證明腸道微生物群與艱難梭菌定植之間有著緊密的聯(lián)系，但是兩者之間具體明確的關系尚不清楚。Buffie等［21］通過建立數(shù)學模型對抗菌藥物處理的小鼠模型進行分析，結果發(fā)現(xiàn)Scindens梭菌與艱難梭菌定植高度相關。Kinnebrew等［14］采用相同的方法對一位接受造血干細胞移植的艱難梭菌腸炎患者的腸道菌群組分進行分析，同樣發(fā)現(xiàn)Scindens梭菌與艱難梭菌定植密切相關?？赡苁且驗镾cindens梭菌的染色體上有膽酸誘導操縱子（bile acid inducible，bai），能夠編碼脫羥基酶調(diào)節(jié)初級膽鹽轉化為次級膽鹽［22］，而次級膽鹽可以抑制艱難梭菌芽孢萌發(fā)。再次證實了腸道微生物群在定植抵抗中的重要作用。

2.2 腸道微生物群的代謝調(diào)節(jié)作用

2.2.1 膽鹽代謝 除了上述定植抵抗機制外，腸道微生物群還可以通過調(diào)節(jié)代謝影響艱難梭菌的生長。初級膽鹽，如?；悄懰岷透拾蹦懰?，是艱難梭菌芽孢的萌發(fā)劑，可促進芽孢轉化為繁殖體；相反，次級膽鹽鵝脫氧膽酸能抑制芽孢萌發(fā)［23］。研究［24］發(fā)現(xiàn)抗菌藥物作用后，微生物群的改變可以增加盲腸內(nèi)?；悄懰猁}含量，降低脫氧膽酸鹽含量從而促進艱難梭菌萌發(fā)。Buffie等［21］將經(jīng)抗菌藥物處理后的小鼠盲腸內(nèi)容物移植到試驗小鼠體內(nèi)，結果顯示艱難梭菌在其體內(nèi)擴散增強；將不經(jīng)處理的且次級膽鹽含量較多的小鼠盲腸內(nèi)容物移植到試驗小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)該小鼠對艱難梭菌的抵抗能力增強。同時還發(fā)現(xiàn)，通過移植四種菌也可以達到抵抗能力增強的效果，其中最重要的就是Scindens梭菌。以上結果均可證實膽鹽代謝在艱難梭菌生長繁殖中的重要作用。

2.2.2 碳水化合物發(fā)酵 腸道微生物發(fā)酵食物可以生成短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA），如乙酸、丙酸、丁酸等。有研究［25］發(fā)現(xiàn)在服用抗菌藥物的人體內(nèi)或者是經(jīng)抗菌藥物處理的動物模型中，短鏈脂肪酸含量均減少，提示短鏈脂肪酸可能與CDI有關。具體機制可能有兩種：一是當短鏈脂肪酸濃度降低時，pH值升高，提示短鏈脂肪酸可能是通過改變腸道的pH值進而影響艱難梭菌的生長；二是通過丁酸發(fā)揮作用。丁酸具有抗炎作用，能夠降低細胞通透性，從而增加腸道內(nèi)抗菌肽含量和黏液量，毛螺菌科和疣微菌科均能產(chǎn)生丁酸，并且這兩種菌科在住院的CDI高危人群以及CDI患者糞便中均顯著減少［26－29］。目前，一些研究雖然都通過動物模型對短鏈脂肪酸在CDI中的作用進行了評估，但結果卻不盡相同。其具體的機制還有待進一步確證。

2.3 腸道微生物群與CDI的治療 腸道微生物群除了能夠很好地降低宿主艱難梭菌感染的敏感性外，還可以治療CDI。糞便菌群移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）就是將健康人的糞便處理后再移植到CDI患者腸道內(nèi)，用于修復患者腸道微生物群的失衡，從而達到治療CDI的作用。此外，F(xiàn)MT治療后患者腸道微生物群穩(wěn)態(tài)的恢復還可以防止萬古霉素治療后CDI的復發(fā)。目前關于FMT的動物實驗較為熱門，一項來自新英格蘭醫(yī)學雜志的報道［30］顯示，F(xiàn)MT用于治療復發(fā)性CDI患者的治愈率高達90%，再次證實了腸道微生物群對艱難梭菌的抵抗和治療作用。但是對于初發(fā)性CDI，F(xiàn)MT的治療效果如何尚不清楚。另外，移植未知菌種后給患者帶來的長期風險尚不可知。因此，隨著測序技術的不斷發(fā)展，F(xiàn)MT未來的發(fā)展方向應該是快速的靶向細菌治療，即鎖定某一種或者幾種已知的菌種治療CDI，不僅可以重新恢復正常菌群，還可以最大程度地限制副作用。Zhang等［31］采用二代測序技術對不同人群進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)無癥狀攜帶者糞便樣本中變形菌門較CDI患者少，但是雙歧桿菌科豐度很高，而雙歧桿菌在CDI患者糞便樣本中是絕對缺乏的。這些數(shù)據(jù)提示相比于整個腸道微生物群的多態(tài)性，某種微生物種類的存在或缺失對于判斷CDI敏感性或治療更重要。但由于腸道微生物群在不同個體間的差異使得尋找到具有CDI生物標記作用或具有定植抵抗作用特定菌種的過程更具挑戰(zhàn)性。

3 免疫反應在艱難梭菌感染過程中的雙重作用

宿主對抗艱難梭菌有3道防線：腸道上皮細胞屏障、固有免疫屏障、獲得性免疫屏障。艱難梭菌在腸道定植后釋放毒素A和毒素B破壞上皮細胞屏障，隨后毒素可直接作用于黏膜細胞和免疫細胞，激活炎癥信號引發(fā)級聯(lián)反應，刺激腸道上皮細胞釋放炎癥因子，如白細胞介素（IL）-8、γ干擾素（IFN-γ）、炎癥性巨噬細胞蛋白-2（MIP-2）、前列腺素2（PGE 2）、生長相關原癌基因（GROα）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）［32］。與此同時，艱難梭菌表面蛋白被宿主腸道內(nèi)蛋白識別受體識別，兩者結合后刺激免疫細胞釋放IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-23、腫瘤壞死因子（TNF）-α和IFN-γ，最終這些促炎癥因子和趨化因子能夠使中性粒細胞、免疫細胞及防御因子聚集，從而引發(fā)一系列免疫反應。適應性免疫反應是抵抗艱難梭菌的最后一道防線，毒素及艱難梭菌表面蛋白都可以引發(fā)機體產(chǎn)生特異性抗體，如抗表面蛋白和毒素A的IgG、抗毒素B的IgA等［32］，從而更好的保護宿主。目前針對艱難梭菌毒素的類毒素疫苗正在研究中，用于保護宿主腸道上皮細胞免于毒素損傷。一直以來CDI過程中宿主免疫反應所起作用的利弊均有爭議，最新研究表明其保護性和致病性同時存在。

3.1 免疫反應的保護作用 免疫反應的實質(zhì)是一

種自我保護的防御機制。非特異性免疫細胞和免疫因子的聚集以及特異性抗體的釋放在CDI過程中均發(fā)揮著重要作用。許多CDI動物模型的研究結果均顯示免疫系統(tǒng)的缺失對機體本身是不利的［33］。瘦素（leptin，LP）是一種和免疫調(diào)節(jié)相關的激素，能夠增強機體清除艱難梭菌的能力，以及增加免疫調(diào)節(jié)因子釋放的作用。此外，固有淋巴細胞，特別是1群淋巴細胞釋放的γ-干擾素，Ⅰ型促炎性細胞因子能夠降低CDI患者的病死率，IL-22、17型促炎性細胞因子能夠提高CDI患者的存活率。此外IL-22還能夠增強免疫細胞的吞噬作用，限制病原菌轉移［34－35］。以上結論均可證實免疫反應在CDI過程的有利作用。

3.2 免疫反應的致病作用 適當?shù)拿庖叻磻獙C體有保護作用，但是當免疫反應過激時同樣也可以對機體造成損傷?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是毒素刺激機體后產(chǎn)生的，ROS能夠參與信號通路介導生成IL-8等免疫因子，但是ROS本身也能損傷腸道［36］。Feghaly等［38］通過檢測 CDI患者糞便中的細胞因子含量發(fā)現(xiàn)免疫反應的強弱和CDI的嚴重程度及持續(xù)時間密切相關。近期相關研究［37－38］也表明體內(nèi)一些炎性標志物的增多可準確預測患者的不良預后。例如趨化因子配體-5（CXCL5）和IL-8作為免疫調(diào)節(jié)因子，能趨化中性粒細胞，但是CXCL5和IL-8水平增高也可減緩CDI患者病情的康復。此外，IL-8表達增多與CDI復發(fā)增加相關，再次證明過度的免疫反應會加重CDI。Buonomo等［39］的研究證實了細胞因子IL-23也能夠增加CDI的嚴重程度，該研究發(fā)現(xiàn)，缺乏IL-23的小鼠，其CDI的致病率和病死率明顯下降，提示CDI過程中，IL-23能夠擾亂免疫環(huán)境，造成腸道損傷?？傊陨涎芯烤C實在CDI過程中，一些免疫因子確實能對機體造成更嚴重的損傷。因此，從免疫反應過程中尋找治療CDI的突破點成為當前炙手可熱的研究方向。例如通過激活或者抑制固有免疫反應中某種信號通路達到減少有害炎癥因子的釋放等。

4 總結和展望

CDI在全球范圍內(nèi)已經(jīng)成為臨床、公共衛(wèi)生和基礎研究等多個領域廣為關注的問題。更多地了解CDI過程能夠為后續(xù)的預防和治療提供新的思路。長期使用抗菌藥物可以對腸道菌群造成不可估量的損害，所以臨床應嚴格把控抗菌藥物的使用指征。此外，F(xiàn)MT、干預免疫反應通路、類毒素疫苗等都為CDI的治療和預防帶來了新的曙光。