豬瘟標(biāo)記疫苗研究進(jìn)展

易 琳 黎 鑫 陳金頂 鄒創(chuàng)智 范雙旗 馬圣明 張媛媛 趙明秋

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

豬瘟（classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）引起的對養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成重大損失的傳染病，具有高致病性、高傳染性的特點(diǎn)，已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染病，并需及時(shí)報(bào)告[1]。2017年，國家不再將CSF列入強(qiáng)制免疫計(jì)劃，對符合條件的養(yǎng)殖場實(shí)行“先打后補(bǔ)”的財(cái)政補(bǔ)助政策，這表明我國CSF防控取得階段性成果，CSF防控開始了新的歷史階段。但CSF防控仍面臨著若干新問題，該病仍以不同臨床表現(xiàn)形式在豬場發(fā)生，阻礙著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[2]。

CSFV屬于瘟病毒屬黃病毒科成員[3,4]，為單股正鏈RNA病毒，基因組5＇端為不加帽的非編碼區(qū)（UTR），3＇端非編碼區(qū)（UTR）無polyA尾[5]。僅有一個(gè)大的開放閱讀框（ORF）編碼含3 898個(gè)氨基酸的多聚蛋白，形成2個(gè)前體蛋白和12個(gè)成熟病毒蛋白（C、Erns、E1、 E2、 Npro、 P7、 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、NS5A和NS5B）[6]，其中E2是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的最主要的保護(hù)性抗原，也是CSFV毒力的決定因子之一[7]。在感染過程中，Erns能產(chǎn)生中和抗體，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，防御CSFV強(qiáng)毒的攻擊。

1 豬瘟疫苗研究的歷史回顧

20世紀(jì)早期，由豬高免血清和CSFV制成的CSF疫苗被研發(fā)出來。隨后，在1936年豬瘟結(jié)晶紫滅活疫苗問世，但是由于低效、不安全，升級的豬瘟弱毒活疫苗繼而被研發(fā)。高效、安全的弱毒活疫苗為此后數(shù)十年全球范圍內(nèi)的CSF防控做出了巨大的貢獻(xiàn)[8]。其中C株被普遍認(rèn)為是最好的弱毒疫苗，幾乎可作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度中和抗體，對CSF各種強(qiáng)毒具有保護(hù)力，且免疫力持久。但是其缺點(diǎn)是缺乏合適的血清學(xué)標(biāo)志物概念，無法分別感染和免疫動(dòng)物[9]。區(qū)別于一般弱毒活疫苗，標(biāo)記疫苗具備安全、穩(wěn)定和高效等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)在免疫動(dòng)物后能誘導(dǎo)區(qū)分野毒感染的抗體。另外，新型豬瘟標(biāo)記疫苗可避免在實(shí)施豬瘟“撲滅計(jì)劃（stamping out policy）”時(shí)因錯(cuò)殺導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失，還能及早發(fā)現(xiàn)感染動(dòng)物，以便及時(shí)采取控制疫情的措施。因此，為了完善我國豬瘟的防控工作，研發(fā)新型的豬瘟標(biāo)記疫苗刻不容緩。

2 豬瘟標(biāo)記疫苗

20世紀(jì)90年代開始，世界各國的研究人員就新型CSF標(biāo)記疫苗進(jìn)行了一系列的探索和研究，諸如亞單位疫苗、重組活載體疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗等，并取得了一定的進(jìn)展[10]。

2.1 豬瘟亞單位疫苗

亞單位疫苗（subunit vaccine），是指剔除病原體中與保護(hù)性免疫無關(guān)的、有害的成分，篩選出有效免疫原成分而制成的疫苗。豬瘟亞單位疫苗主要是E2蛋白的亞單位標(biāo)記疫苗。利用E2蛋白開發(fā)的亞單位疫苗在抵抗CSFV野毒株的同時(shí)，通過抗Erns蛋白的抗體檢測，能夠區(qū)分出免疫的和感染的豬。1999年，歐盟開始大規(guī)模研發(fā)E2蛋白亞單位疫苗，并成功誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生抗CSFV的免疫保護(hù)[11]。近年來，越來越多的研究人員在多種表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，對豬瘟E2亞單位疫苗進(jìn)行了更深層次的研究，如利用腺病毒表達(dá)外膜結(jié)構(gòu)蛋白E2與IFNα的亞單位疫苗[12]，畢赤酵母表達(dá)[13]、轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)[14]、桿狀病毒表達(dá)[15]和基因工程乳桿菌表達(dá)[16]的E2亞單位疫苗。其中，Suárez等[17,18]使用基于慢病毒的基因遞送系統(tǒng)來獲得穩(wěn)定的重組HEK 293細(xì)胞系，用于表達(dá)與豬CD154融合的E2-CSFV抗原。隨后，將E2-CD154新型豬瘟亞單位疫苗用于免疫接種試驗(yàn)，相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果顯示，該疫苗接種試驗(yàn)豬14天后能夠完全抵抗CSFV強(qiáng)毒株攻擊，且能對CSFV的垂直傳播起到很好的預(yù)防效果。在安全性和DIVA特性上，E2-CD154亞單位疫苗初步展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。綜上所述，豬瘟E2亞單位疫苗具備良好的保護(hù)力，是將來防控豬瘟的重要疫苗。

2.2 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗把對宿主無害的活病毒作為載體，構(gòu)建出能夠穩(wěn)定表達(dá)保護(hù)性抗原的重組病毒的疫苗。在豬瘟重組活載體疫苗研究中，主要使用的載體病毒有牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）、痘苗病毒（vaccinia virus,VV）、偽狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）和豬腺病毒（porcine adenovirus,PAV）。

2.2.1牛病毒性腹瀉病毒載體疫苗

黃病毒科瘟病毒屬成員在核苷酸序列、抗原結(jié)構(gòu)和血清學(xué)反應(yīng)上關(guān)系密切，可通過將對應(yīng)的基因互換構(gòu)建重組活載體疫苗，其生物學(xué)特性和血清學(xué)反應(yīng)與親本病毒不同，可作為一種標(biāo)記疫苗。2014年，CP7_E2alf（SuvaxynCSF Marker,Zoetis）被授權(quán)為首例針對豬瘟的活標(biāo)記疫苗，獲得了歐洲藥品管理局（EMA）的注冊許可，并被投入市場應(yīng)用。Meyers等[19]構(gòu)建了感染性cDNA克隆BVDV弱毒株“CP7”，Reimann等[20]運(yùn)用反向遺傳等技術(shù)，構(gòu)建了嵌合病毒CP7-E2alf，即以CP7株為骨架，用CSFV“Alfort/187”替換了相應(yīng)的E2基因。隨之對該嵌合病毒進(jìn)行安全性、效能、免疫原性及標(biāo)記等一系列研究表明，CP7_E2alf疫苗同傳統(tǒng)的豬瘟減毒活疫苗一樣安全有效[21]，對于不同基因型的CSFV毒株感染都具保護(hù)效力[22]。接種CSFV強(qiáng)毒株“Eystrup”1周內(nèi)即可獲得全面的臨床保護(hù)，且免疫力至少持續(xù)6個(gè)月。但是口服疫苗會影響免疫效力[23]。懷孕的母豬及其胎兒通過注射單劑量的CP7_E2alf疫苗得到充分保護(hù)，完全防止了中等毒力CSFV的垂直傳播[24]，然而，接種CP7_E2alf疫苗的動(dòng)物與BVDV和BDV毒株存在交叉反應(yīng)，因此特異性受到影響，并且多重接種和受限的樣本都會降低特異性[25]。因此，解決該疫苗在實(shí)際中的應(yīng)用還需新的方法和檢測系統(tǒng)[26]。

2.2.2 痘病毒載體疫苗

痘病毒（poxvirus）的基因組有大量的非必需區(qū)域，可通過將外源基因插入到這些區(qū)域同時(shí)表達(dá)多個(gè)目的基因，且各基因表達(dá)互不干擾，遺傳穩(wěn)定，不影響病毒復(fù)制。20世紀(jì)90年代起，國內(nèi)外先后利用痘病毒構(gòu)建豬瘟病毒載體疫苗。Voigt等[27]先抑制性處理了豬外周血中的淋巴細(xì)胞，隨后用重組口瘡病毒ORFV VrV-E2對豬進(jìn)行免疫攻毒試驗(yàn)，免疫豬血液中未檢測到CSFV存在，同時(shí)也無臨床癥狀。李譜華等[28]成功構(gòu)建了含有豬瘟E2基因的重組雞痘病毒FV282-CSFV-E2，對試驗(yàn)豬進(jìn)行疫苗免疫，然后用CSFV強(qiáng)毒石門株以100 LD接毒量攻擊，保護(hù)率為75%，為后續(xù)豬瘟標(biāo)記疫苗的研發(fā)提供了參考。

2.2.3 偽狂犬病病毒載體疫苗

豬偽狂犬病病毒（PRV）具有大量可供外源基因插入的位點(diǎn)，在病毒啟動(dòng)子和特定反式調(diào)節(jié)因子的共同作用下，插入的外源基因能夠成功表達(dá)。現(xiàn)有的PRV基因缺失疫苗安全性高并已在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。Peeters等[29]構(gòu)建了gD/gE雙缺失的重組病毒并可穩(wěn)定表達(dá)CSFV E2蛋白，隨后制備疫苗進(jìn)行免疫攻毒試驗(yàn)。結(jié)果表明，免疫攻毒豬后能同時(shí)產(chǎn)生針對PRV和CSFV的保護(hù)抗體，存活率為100%。韓爽等[30]以構(gòu)建的TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的綠色熒光標(biāo)記豬偽狂犬病毒rPRV-BE為親本株，使用同源重組技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)CSFV C株E2的重組偽狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC。重組病毒rPRV-CSFV PE2SC較野毒PRV（SX株）、親本毒rPRV-BE前期增殖效率高，病毒滴度到達(dá)峰值時(shí)間短，而峰值病毒滴度低于野毒，與親本毒差異不大。結(jié)果顯示構(gòu)建的重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性及體外復(fù)制能力，為進(jìn)一步研發(fā)PRV基因缺失重組疫苗提供參考。

2.2.4 腺病毒載體疫苗

腺病毒載體具備多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，例如宿主范圍廣、感染細(xì)胞類型多、可高滴度制備、外源基因克隆量大，被廣泛應(yīng)用于重組疫苗的研究當(dāng)中。孫元等[32,33]通過細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建了含有豬瘟病毒E2基因的重組腺病毒rAdV-E2。然后用rAdV-E2免疫兔和豬，兔只未出現(xiàn)定型熱反應(yīng)，豬只則完全抵抗CSFV強(qiáng)毒石門株。李河林[34]構(gòu)建了共表達(dá)CSFV E2基因和耶爾森菌侵襲素基因C端（InvC）的重組腺病毒載體疫苗rAdV-E2-InvC，并對動(dòng)物進(jìn)行免疫攻毒試驗(yàn)，表明其能誘導(dǎo)產(chǎn)生CSF特異性抗體并發(fā)揮免疫作用。在此基礎(chǔ)上，用FMDV 2A蛋白連接多個(gè)基因，進(jìn)一步構(gòu)建了rAdV-Erns-2A-E2-2A-InvC、rAdV-Erns-2A-E2-2A-IL2和 rAdV-Erns-2A-E2-2A-NS3 3個(gè)重組疫苗。家兔免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，這3種疫苗均有免疫保護(hù)作用。這些研究成果為新型豬瘟標(biāo)記疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2.3 DNA標(biāo)記疫苗

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是指將編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA（有時(shí)也可是RNA）通過一定途徑轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，其被宿主細(xì)胞攝取后并表達(dá)出抗原，從而誘導(dǎo)特異性的免疫反應(yīng)，起到免疫保護(hù)作用。迄今為止，所有的豬瘟候選DNA標(biāo)記疫苗都是在豬瘟病毒主要保護(hù)性抗原E2蛋白的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的重組質(zhì)粒構(gòu)建體，基于Erns或NS3蛋白特異性抗體的檢測作為DIVA標(biāo)記原則。余興龍等[35]構(gòu)建了E2基因的4種真核表達(dá)質(zhì)粒。其中用有信號肽序列的pcDSW對小鼠進(jìn)行免疫試驗(yàn)，結(jié)果顯示，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗CSFV的抗體，所免疫的豬在強(qiáng)毒的攻擊下保護(hù)率達(dá)100%。然而，臨床上使用豬瘟DNA疫苗時(shí)存在2個(gè)問題：①免疫劑量大，免疫次數(shù)多，有時(shí)激發(fā)的免疫反應(yīng)弱，無法獲得理想的免疫效果；②導(dǎo)入細(xì)胞和機(jī)體的效率差，抗原表達(dá)水平低[36]。為了提高豬瘟DNA疫苗的免疫效果，可用細(xì)胞因子作為佐劑共表達(dá)E2基因。Li等[37]融合表達(dá)四跨膜蛋白分子CD81后發(fā)現(xiàn)，其能夠提高中和抗體滴度和保護(hù)力，加強(qiáng)E2 DNA疫苗的免疫效力?？偠灾珼NA標(biāo)記疫苗顯示出良好的應(yīng)用前景。

2.4 反式互補(bǔ)缺失突變體 （復(fù)制子）疫苗

豬瘟的反式互補(bǔ)缺失突變體（復(fù)制子）疫苗通常是CSFV的Erns或E2的反式互補(bǔ)缺失突變體。因結(jié)構(gòu)基因被外源基因所代替，故該類疫苗生物安全性高。在這類豬瘟復(fù)制子候選疫苗中，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研發(fā)的腺病毒甲病毒復(fù)制子嵌合載體疫苗rAdV-SFV-E2最具潛力。對此疫苗進(jìn)行最早提供完全攻毒保護(hù)時(shí)間的研究，結(jié)果顯示，rAdV-SFV-E2免疫后3周和4周，能夠完全抵抗致死性CSFV強(qiáng)毒的攻擊[38]。且免疫效力未受其母源抗體的顯著干擾，免疫30日齡的仔豬后能夠完全抵抗致死性CSFV強(qiáng)毒石門株的攻擊[39]。另外，皮下免疫途徑對于該豬瘟疫苗更為有效[40]。最后同時(shí)接種偽狂犬病活疫苗Bartha-K61株和嵌合載體豬瘟疫苗rAdV-SFV-E2，監(jiān)測免疫效果表明，同時(shí)免疫rAdV-SFV-E2和偽狂犬病疫苗Bartha-K61對rAdV-SFV-E2的免疫效果無干擾現(xiàn)象[41]。

2.5 基因缺失/突變疫苗

基因缺失疫苗是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，尋找與病毒復(fù)制無關(guān)但與病毒毒力相關(guān)的基因，然后將毒力基因部分或全部敲除，且保留其免疫原性的基因工程疫苗。而CSFV感染宿主誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體主要與Erns以及E2發(fā)生反應(yīng)[42]。Widjojoatmodjo等[43]通過基因缺失CSFV Erns構(gòu)建了突變毒株FL22株（缺66個(gè)氨基酸）和FL23株（缺215個(gè)氨基酸），隨后對試驗(yàn)豬進(jìn)行免疫攻毒試驗(yàn)，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，有較好的保護(hù)作用，同時(shí)針對CSFV Erns蛋白抗體建立了DIVA診斷方法。Holinka等[44,45]在El蛋白序列中插入“Flag”標(biāo)記性抗原表位的同時(shí)，對E2基因中單克隆抗體WH303的結(jié)合表位進(jìn)行突變，產(chǎn)生陰性標(biāo)記，拯救出重組病毒FlagT4v。接種試驗(yàn)豬后，可產(chǎn)生對抗強(qiáng)毒株的保護(hù)力。試驗(yàn)豬產(chǎn)生的抗體可特異性結(jié)合Flag表位，而不與WH303表位合成的多肽結(jié)合，達(dá)到了鑒別的目的。隨后，突變了FlagT4的E1和E2易突變區(qū)域的密碼子，構(gòu)建了豬瘟弱毒疫苗FlagT4Gv，對試驗(yàn)豬進(jìn)行攻毒后，結(jié)果表明具有良好免疫保護(hù)效果且遺傳特性穩(wěn)定，但與該疫苗配套的DIVA檢測方法還在進(jìn)一步研究當(dāng)中。綜上所述，基因缺失/突變疫苗因具有幾乎所有的CSFV抗原表位，但又大大降低了毒力，為有目的性地構(gòu)建弱毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。

3 展望

疫苗免疫是現(xiàn)今防控豬瘟最有效的辦法。安全、高效的豬瘟弱毒活疫苗為數(shù)十年間豬瘟的有效防控作出了不可磨滅的貢獻(xiàn)，但傳統(tǒng)的豬瘟兔化弱毒疫苗由于缺乏標(biāo)記策略，在豬瘟凈化中受到了較大限制。豬瘟流行情況的復(fù)雜性及臨床疾病的非典型性使該疾病的預(yù)防愈加困難，因此，研發(fā)新型的豬瘟標(biāo)記疫苗并不斷地加以改進(jìn)日益受到關(guān)注。目前大多數(shù)新型豬瘟標(biāo)記疫苗的研究仍處于試驗(yàn)階段。綜合本文的概述可發(fā)現(xiàn)，各種候選疫苗仍存在許多缺點(diǎn)，不夠完善。對新型豬瘟標(biāo)記疫苗設(shè)計(jì)策略研究的同時(shí)，需要注意的是對已有候選豬瘟標(biāo)記疫苗優(yōu)化問題的解決，使其真正地商品化，為養(yǎng)豬業(yè)有效防控豬瘟提供新的途徑，更好地實(shí)現(xiàn)對豬瘟的控制和凈化。