樹(shù)突狀細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在兒童再生障礙性貧血中的作用研究

劉志強(qiáng) ，夏昱 ，陶敏 ，柯江維

再生障礙性貧血（AA）是一組由化學(xué)、物理、生物因素及不明原因引起的骨髓造血干細(xì)胞及造血微環(huán)境損害，骨髓造血功能低下及全血細(xì)胞減少的疾病。引起AA發(fā)生的確切原因尚不明了，目前越來(lái)越多的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究表明，免疫系統(tǒng)紊亂在AA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，第46屆美國(guó)血液學(xué)年會(huì)明確提出AA是自身免疫性疾病，免疫異常表現(xiàn)在T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)[1]。DCs是適應(yīng)性免疫的主要啟動(dòng)者，是體內(nèi)最重要的專職抗原提呈細(xì)胞（APC），在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特的地位。Treg細(xì)胞是一種調(diào)節(jié)性的T細(xì)胞，其主要功能為抑制效應(yīng)T細(xì)胞，維持免疫耐受，預(yù)防自身免疫性疾病發(fā)生。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析AA患者外周血DCs和Treg細(xì)胞數(shù)量的變化及兩者的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討AA發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2013年1月至2017年4月期間我院血液科收治的初診再生障礙性貧血患兒31例為病例組，其中男19例，女12例，年齡3至14歲，平均年齡8歲9個(gè)月。以上病例的診斷均參照國(guó)際再障診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。同期來(lái)我院門(mén)診健康體檢兒童26例為對(duì)照組，其中男15例，女11例，年齡4至13歲，平均年齡9歲1個(gè)月。兩組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集AA初診患兒及健康對(duì)照組兒童靜脈血lml，置含肝素抗凝管中，標(biāo)本2h內(nèi)檢測(cè)。

1.2.2 淋巴細(xì)胞CD系列表達(dá)檢測(cè) 每份待測(cè)標(biāo)本分三管，相應(yīng)取美國(guó)BD公司CD4-FITC、CD25-APC、CD127-PE，Lin2 （CD3、CD14、CD19、CD20、CD56）FITC 混 合 抗 體 ，HLA-DR-PerCP、CD11c-PE-cy7、CD123-APC鼠抗人熒光單克隆抗體10ml，加入肝素抗凝血100μl，混勻，室溫避光孵育20min，分別加入1×紅細(xì)胞裂解液1ml，室溫避光放置 10min，1000r/min離心 5min， 棄上清液，用PBS洗滌2次，棄上清，加PBS 250μl懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。采用BD公司FACSCanto流式細(xì)胞儀檢測(cè)，BD FACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件處理， 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示表示，組間均數(shù)比較采用配對(duì)和成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的相關(guān)信息

2.1 外周血DC1和DC2占淋巴細(xì)胞的百分比 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兒童AA的研究亦發(fā)現(xiàn)AA患兒外周血DC1占淋巴細(xì)胞的百分比高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而外周血 DC2 占淋巴細(xì)胞的百分比與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 外周血DC1和DC2占淋巴細(xì)胞的百分比

2.2 外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比 AA患兒外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 見(jiàn)表 2。

表2 外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比

2.3 外周血DC1和Treg的相關(guān)性 分析顯示AA組和對(duì)照組DC1和Treg細(xì)胞在數(shù)量上呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 DC1和Treg細(xì)胞水平對(duì)比及相關(guān)性分析

3 討論

目前認(rèn)為T(mén)淋巴細(xì)胞異常活化、功能亢進(jìn)不僅參與了兒童感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]，亦是造成骨髓損傷、造血細(xì)胞凋亡及造血功能衰竭的主要原因。Treg細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞的亞群，它們通過(guò)細(xì)胞間接觸和分泌抑制性細(xì)胞因子(TGF-β、IL-10等)方式發(fā)揮抑制功能[4]。Treg細(xì)胞的抑制性功能在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、誘導(dǎo)免疫耐受及防止AID的發(fā)生方面起著重要作用。有研究顯示在急性白血病、特發(fā)性血小板減少性紫癜等血液系統(tǒng)疾病中存在Treg數(shù)量和功能的異常[5，6]。亦有研究表明，AA患者外周血也存在Treg數(shù)量和功能的異常。Solomou EE等[7]首次發(fā)現(xiàn)，確診再障的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Treg細(xì)胞數(shù)量減低；其中7例接受免疫抑制治療后出現(xiàn)造血應(yīng)答的患者中，有6例的Treg細(xì)胞數(shù)量和Foxp3表達(dá)水平相對(duì)未治療前均輕微升高；而3例接受免疫抑制治療達(dá)到完全緩解 (CR)的患者，Treg細(xì)胞數(shù)量較治療前增加。王西閣等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，急慢性AA患兒Treg細(xì)胞百分均低于對(duì)照組，與Solomou EE研究結(jié)果一至，且在SAA中Treg細(xì)胞比例進(jìn)一步降低。在對(duì)獲得性AA研究中發(fā)現(xiàn)，病例組與健康對(duì)照組相比CD4+CD25+T細(xì)胞、CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比及其絕對(duì)值均明顯降低，經(jīng)免疫抑制治療 (IST)3～6個(gè)月后Treg數(shù)量比治療前有所提高[7]。提示CD4+CD25+FOXP3+Treg在絕大多數(shù)AA患者中都是降低的，隨著IST有效，病情緩解，Treg數(shù)量上升。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兒童AA的研究亦發(fā)現(xiàn)AA患兒外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比低于健康對(duì)照組。Treg細(xì)胞是一類具有重要調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，具有免疫低反應(yīng)性和免疫抑制性兩大功能，其正常水平和功能的維持有助于免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原的刺激建立良好的耐受狀態(tài)[9]。正常狀態(tài)下，機(jī)體不存在自身免疫反應(yīng)，最重要的原因就是Treg細(xì)胞的存在抑制了自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化。由此推測(cè)Treg缺乏，自身反應(yīng)性T細(xì)胞增加，機(jī)體免疫耐受被打破，啟動(dòng)自身免疫應(yīng)答，免疫效應(yīng)細(xì)胞增多，功能亢進(jìn)，促進(jìn)AA發(fā)生。

DCs是適應(yīng)性免疫的主要啟動(dòng)者，是體內(nèi)最重要的APC。DCs既能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，同時(shí)在誘導(dǎo)免疫耐受中也十分重要。根據(jù)來(lái)源不同，DC細(xì)胞可以分為DC1和DC2（mDC和pDC）。余詩(shī)炎等[10]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎患者外周血中mDC比例顯著高于對(duì)照組，胸腔積液中mDC比例高于外周血。重型AA患者的骨髓中，未成熟的和激活的DC1均明顯增加，且兩者比例失衡，促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1型分化，使自身免疫耐受被打破、T細(xì)胞功能亢進(jìn)而導(dǎo)致造血功能衰竭[11]。此外，還發(fā)現(xiàn)初發(fā)重型AA患者外周血中髓系DC前體（pDC1）顯著增多，并且pDC1與淋巴細(xì)胞系DC前體（pDC2）比值明顯失衡，與正常對(duì)照組存在差異；而在恢復(fù)期時(shí)上述指標(biāo)下降，與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12]。Liu等[13]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析mDC蛋白表達(dá)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)和丙酮酸激酶M2型蛋白(PKM2)在初治SAA患者mDC中表達(dá)上調(diào)；其中PKM2在進(jìn)一步鑒定中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是蛋白水平還是mRNA水平在SAA患者mDC內(nèi)表達(dá)均明顯增高。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兒童AA的研究亦發(fā)現(xiàn)AA患兒外周血DC1占淋巴細(xì)胞的百分比高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；外周血DC2占淋巴細(xì)胞的百分比與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DC1分泌白細(xì)胞介素-12（IL-12）使機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)加劇，促使Th0向Th1細(xì)胞分化并促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌γ干擾素（IFN-γ），進(jìn)一步加劇了機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而促進(jìn)AA發(fā)生。DC2則分泌IL-4，使Th0向Th2細(xì)胞分化，但DC2主要與B淋巴細(xì)胞功能有關(guān)，具有一定的吞噬、攝取、加工抗原的能力，但抗原呈遞能力低。由此可知，AA患者的DC亞群存在異常，其與激活Th1細(xì)胞相關(guān)的DC1明顯增多相關(guān)。這表明AA患者骨髓中DC1處于功能亢進(jìn)狀態(tài)，可能是導(dǎo)致AA疫耐受被打破的重要因素。而抗原刺激則有可能是激活A(yù)A患者DC1，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫“瀑布”反應(yīng)的始動(dòng)因素。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，AA組和對(duì)照組DC1和Treg細(xì)胞在數(shù)量上呈負(fù)相關(guān)。一般認(rèn)為，DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)性T細(xì)胞還是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在很大程度上取決于其成熟狀態(tài)，即DCs/imDCs的比例[14]。有研究表明，來(lái)源胸腺的Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，不需要和專門(mén)的DCs相互作用，而主要與胸腺內(nèi)皮細(xì)胞和自身抗原有關(guān)[15]。亦有研究[16]認(rèn)為AA患者骨髓中B淋巴細(xì)胞可以通過(guò)協(xié)同刺激因子影響Treg細(xì)胞導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞異?；罨?，進(jìn)而使骨髓造血功能衰竭。另外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生依賴于所處的環(huán)境，在一定的環(huán)境下，T細(xì)胞遇到自身或外源抗原，由于DCs表面的協(xié)同刺激分子的表達(dá)改變或者細(xì)胞因子的格局變化亦可影響T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。有關(guān)DCs與Treg相互作用的分子機(jī)制還不很清楚，涉及的層面和環(huán)節(jié)非常復(fù)雜，還有待于進(jìn)一步研究。