雞傷寒病原的分離鑒定

文│張立斌（遼寧省建平縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

雞傷寒是由雞傷寒沙門氏菌引起的急性敗血性或呈慢性經(jīng)過的傳染病，主要病變器官為肝、脾等，以連帶下痢為主要特征。該菌呈短粗的桿狀，大小為（1.0～2.0）×1.5微米，常單個(gè)散在，偶爾成對(duì)存在。革蘭氏染色為陰性，不形成芽孢，無莢膜，無鞭毛。雞沙門氏菌易在pH7.2的牛肉膏瓊脂、牛肉浸液瓊脂及其他營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，需氧、兼性厭氧，在37℃條件下生長(zhǎng)最佳。該菌在硒酸鹽和四磺酸肉湯等選擇培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，在麥康凱、亞硫酸鉍、S.S瓊脂、去氧膽酸鹽、去氧膽酸鹽枸櫞酸鹽乳糖蔗糖和亮綠瓊脂等鑒別培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)。該菌在營養(yǎng)瓊脂上形成細(xì)小、濕潤、圓形藍(lán)灰色菌落，邊緣整齊。在肉湯中生長(zhǎng)形成絮狀沉淀。

一、材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)材料。

（1）病料來源。2017年5月，10只病死雞均取自遼寧省建平縣某雞場(chǎng)。

（2）實(shí)驗(yàn)器材。冰箱、分析天平、電子天平、光學(xué)顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌鍋。

（3）實(shí)驗(yàn)試劑。染色液、營養(yǎng)瓊脂、普通肉湯、S.S瓊脂、HE瓊脂、三糖鐵瓊脂、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、伊紅美蘭、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基及微量生化發(fā)酵管，按常規(guī)方式配制而成。

2.實(shí)驗(yàn)方法。

（1）細(xì)菌的分離。在無菌條件下，采取病死雞的肝、脾、腎，分別接種在普通營養(yǎng)瓊脂、伊紅美蘭、麥康凱、HE瓊脂、SS瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，放置于37℃溫箱培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，以觀察其生長(zhǎng)狀況和菌落分布等特征。

（2）染色鏡檢。取得典型單個(gè)菌落在干凈的玻片上，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察其形態(tài)特征。

（3）初步確認(rèn)。從分離平板上挑取該菌疑似菌落3～5個(gè)或更多個(gè)同時(shí)接種三糖鐵瓊脂TSI和尿素培養(yǎng)基，觀察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣及運(yùn)動(dòng)性狀況。用接種棒挑取S.S培養(yǎng)基上典型菌落混勻，進(jìn)行空白對(duì)比，觀察是否出現(xiàn)絮狀凝集沉淀，這樣可以初步篩選得到沙門氏菌。

（4）細(xì)菌純化。挑去典型細(xì)菌劃線接種于麥康凱、HE、S.S瓊脂、伊紅美蘭培養(yǎng)基上，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)純化培養(yǎng)24小時(shí)，觀察其生長(zhǎng)及菌落情況。經(jīng)過反復(fù)數(shù)代培養(yǎng)，無雜菌生長(zhǎng)時(shí)接種在亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）中增菌待用。

（5）生化實(shí)驗(yàn)。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生化鑒定。用分離純化培養(yǎng)物進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、M.R.和VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)和葡萄糖、甘露醇、麥芽糖等用于鑒定腸桿菌常用的微量發(fā)酵管試驗(yàn)，同時(shí)接種三糖鐵斜面培養(yǎng)基中，在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)72小時(shí)后觀察其生化反應(yīng)特性。

二、結(jié)果

1.形態(tài)學(xué)觀察特征。取得單個(gè)菌落涂于玻片上，革蘭氏染色，油鏡下觀察，可見大量?jī)啥蒜g圓、短小，多數(shù)為單一存在的陰性小桿菌，該菌種無芽孢、無莢膜。

2.細(xì)菌培養(yǎng)特征。該菌株在普通瓊脂呈現(xiàn)圓形、稍凸起、灰白色、光滑、邊緣整齊形態(tài)不一的菌落；麥康凱培養(yǎng)基呈現(xiàn)長(zhǎng)勢(shì)較好、無色、圓形小菌落，且培養(yǎng)基不變色； HE培養(yǎng)基上為藍(lán)綠色或藍(lán)色菌落，且菌落中心幾乎變成黑色；S.S培養(yǎng)基上為無色半透明，中部多數(shù)有黑點(diǎn)或基本無黑點(diǎn)，直徑1～2毫米，圓形光滑菌落；伊紅美藍(lán)平板為微微凸起、表面光滑、圓形、邊緣整齊的淡藍(lán)色小菌落，直徑1～2毫米；同時(shí)，將挑取一個(gè)菌落接種在普通肉湯試驗(yàn)管，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，呈一致混濁，管底出現(xiàn)灰白色沉淀物。

3.生化反應(yīng)特征。將該菌株接種在微量生化反應(yīng)管后，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果，不液化明膠，不分解尿素，不發(fā)酵乳糖和蔗糖，能發(fā)酵葡萄糖、甘露醇和麥芽糖，大多產(chǎn)酸產(chǎn)氣，少數(shù)只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。VP試驗(yàn)陰性。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)為陽性；MR 試驗(yàn)為陽性；VP 試驗(yàn)為陰性；在TSI中為產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、斜面變紅，管體有的呈黑色或黃色，底層黃色，產(chǎn)生硫化氫氣體，由此判定該菌株符合沙門氏菌的生化反應(yīng)特性。

三、討論

根據(jù)分離菌株的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、培養(yǎng)特征和生化特征，符合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中規(guī)定的相關(guān)特性。

四、結(jié)論

從建平縣某雞場(chǎng)采集的臨床疑似傷寒病雞，無菌條件下取肝、脾等病料分離病原，根據(jù)分離菌的形態(tài)學(xué)特性、培養(yǎng)特征和生化特征，確定分離菌為雞沙門氏菌。