腸球菌對(duì)利奈唑胺耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

李 培， 林東昉

腸球菌系革蘭陽(yáng)性球菌，廣泛存在于人和動(dòng)物的消化道及女性生殖道中，是重要的條件致病菌，多見于醫(yī)院感染。由于細(xì)菌固有耐藥和獲得性耐藥的雙重特性，以及各類抗生素廣泛應(yīng)用于臨床造成的高選擇性壓力，導(dǎo)致多重耐藥（multiple drug resistance，MDR）腸球菌增多，甚至出現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素腸球菌（vancomycin-resistant enterococci，VRE）。2000年利奈唑胺上市，是首個(gè)應(yīng)用于臨床的唑烷酮類抗菌藥物，用于治療MDR革蘭陽(yáng)性菌感染，尤其是治療VRE和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。近年來(lái)，利奈唑胺耐藥腸球菌的數(shù)量呈逐年增多趨勢(shì)，同時(shí)新耐藥機(jī)制的發(fā)現(xiàn)也使此藥在臨床上的使用遇到了挑戰(zhàn)。

1 腸球菌的耐藥性

腸球菌細(xì)胞壁堅(jiān)厚，對(duì)很多抗生素呈固有耐藥。例如通過(guò)產(chǎn)生低親和力的青霉素結(jié)合蛋白（PBP）[1]。由于細(xì)胞壁的作用導(dǎo)致藥物滲透障礙和產(chǎn)生氨基糖苷類抗生素低水平耐藥。此外，腸球菌可以通過(guò)靶位改變、產(chǎn)生各種酶類（如鈍化酶、水解酶等）、獲得可轉(zhuǎn)移的耐藥基因、主動(dòng)外排等機(jī)制對(duì)各類抗生素如β內(nèi)酰胺類、糖肽類、氨基糖苷類（高水平）、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磷霉素類等耐藥。在對(duì)VRE的研究過(guò)程中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM、vanN等耐藥基因亞型，此類基因通過(guò)影響細(xì)胞壁對(duì)糖肽類抗生素的親和力而介導(dǎo)耐藥。腸球菌對(duì)新型抗菌藥物利奈唑胺的耐藥機(jī)制如23S rRNA突變、cfr基因等將于下文進(jìn)行描述。

2 中國(guó)腸球菌耐藥性變遷

耐藥菌株的出現(xiàn)與抗生素的使用緊密相關(guān)，對(duì)腸球菌耐藥率的統(tǒng)計(jì)和研究能更全面地指導(dǎo)臨床用藥。

2005－2016年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)革蘭陽(yáng)性菌株中腸球菌分離率在30%上下波動(dòng)，2016年為29.3%[2-13]。其中最主要的兩種腸球菌，糞腸球菌和屎腸球菌對(duì)慶大霉素、氯霉素、磷霉素等耐藥率有下降趨勢(shì)，糞腸球菌對(duì)上述抗生素耐藥率分別從61.4%、43.5%、15.7%下降至33.0%、23.4%、3.0%，屎腸球菌則分別從81.9%、8.5%、31.2%下降至48.0%、5.8%、19.9%。對(duì)左氧氟沙星的耐藥率比較穩(wěn)定，兩種菌分別在25%和85%左右。對(duì)紅霉素、利福平等的耐藥率居高不下，均在50%以上。對(duì)萬(wàn)古霉素、替考拉寧、利奈唑胺等耐藥率目前處于低水平，均低于4%。備受關(guān)注的VRE，11年來(lái)，其耐藥率目前也僅為0.4%（糞腸球菌）和1.9%（屎腸球菌）。參考上述數(shù)據(jù)，雖然腸球菌對(duì)利奈唑胺耐藥率絕對(duì)值不是很高，但在最新2016年監(jiān)測(cè)報(bào)告中糞腸球菌對(duì)利奈唑胺耐藥率已有1.2%；屎腸球菌為0.2%。這些近年出現(xiàn)的利奈唑胺耐藥菌株不容忽視，了解利奈唑胺的作用機(jī)制更有助于解決目前臨床應(yīng)用所遇到的問(wèn)題。

3 利奈唑胺的作用機(jī)制與抗菌活性

利奈唑胺是一種細(xì)菌蛋白質(zhì)合成抑制劑。它是通過(guò)結(jié)合核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶活性中心（peptidyl transferase center，PTC）的A位點(diǎn)發(fā)揮作用。A位點(diǎn)位于核糖體催化功能核心23S rRNA的V區(qū)[14]。利奈唑胺與50S核糖體亞基的結(jié)合，使3'末端氨基酰-tRNA（fMet-tRNA）受到干擾而無(wú)法進(jìn)行肽酰轉(zhuǎn)移，抑制蛋白質(zhì)合成的初始階段，但不影響翻譯起始tRNA的形成、延伸與終止階段[15]，這與以往抗菌藥物抑制蛋白合成的作用方式不同。獨(dú)特的作用特點(diǎn)使利奈唑胺與其他抗菌藥物不容易發(fā)生交叉耐藥，在體外也不容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。

利奈唑胺對(duì)MRSA和VRE等革蘭陽(yáng)性菌，在體外和體內(nèi)均具有抑菌活性[16]，對(duì)肺炎鏈球菌等鏈球菌屬具有殺菌作用，對(duì)革蘭陰性菌幾乎沒(méi)有抗菌活性，但對(duì)厭氧菌有一定活性[17]。在健康人體內(nèi)，利奈唑胺口服后平均絕對(duì)生物利用度可達(dá)100%。穩(wěn)態(tài)分布容積與人體含水總量相當(dāng)，滲透性強(qiáng)，半衰期長(zhǎng)，其代謝產(chǎn)物主要通過(guò)尿液排泄[18]。良好的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)特性也使利奈唑胺在臨床上用于革蘭陽(yáng)性菌感染治療頗有優(yōu)勢(shì)。

4 腸球菌耐利奈唑胺的耐藥機(jī)制

根據(jù)2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)指南（CLSI），當(dāng)利奈唑胺對(duì)腸球菌MIC≥8 mg/L時(shí)，定義為耐藥；4 mg/L，為中介；≤2 mg/L，為敏感。根據(jù)已知的耐藥機(jī)制，可以分為兩大類。

4.1 非轉(zhuǎn)移性耐藥

4.1.1 23S rRNA V區(qū)突變 此突變是目前已知最主要的耐藥機(jī)制，且糞腸球菌比屎腸球菌更容易被誘導(dǎo)突變[19]。突變方式為點(diǎn)突變，最常見的突變位置為G2576U[20]。有研究表明，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后V區(qū)2576位核苷酸發(fā)生突變，糞腸球菌和屎腸球菌的MIC在此位點(diǎn)突變后均有不同程度的升高，分別上升至8～128 mg/L和8～64 mg/L[21]，與突變23S rRNA拷貝數(shù)呈正相關(guān)。另外在耐藥腸球菌株中還發(fā)現(xiàn)有C2192T、C2461T、U2500C、A2503G、G2505A等位點(diǎn)的突變。

4.1.2 核糖體蛋白L3、L4或L22突變r(jià)plC、rplD、rplV基因分別編碼核糖體蛋白L3、L4、L22。在金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌株中發(fā)現(xiàn)這些核糖體蛋白的突變可導(dǎo)致對(duì)利奈唑胺由敏感變?yōu)槟退嶽22]。在腸球菌中此突變所致的利奈唑胺耐藥很少見，但最近有研究發(fā)現(xiàn)1株耐利奈唑胺屎腸球菌中存在核糖體蛋白L4上Asn130Lys的突變，同時(shí)此株菌也含有另外一個(gè)利奈唑胺耐藥基因optrA[23]，是否L4突變可影響腸球菌的耐藥性值得進(jìn)一步探究。

4.2 轉(zhuǎn)移性耐藥

此類耐藥通過(guò)外源性質(zhì)粒介導(dǎo)。

4.2.1 氯霉素-氟甲砜霉素耐藥（cfr）基因

4.2.1.1cfr基因[24]cfr基因?qū)儆赟-腺苷甲硫氨酸（SAM）酶蛋白質(zhì)超家族，在自然界中廣泛存在，是多重耐藥基因。它通過(guò)編碼cfr甲基轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)菌核糖體23S rRNA肽酰轉(zhuǎn)移酶區(qū)域A2503位C8甲基化[25]產(chǎn)生耐藥。該基因可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)氯霉素類、林可酰胺類、唑烷酮類等抗菌藥物耐藥。介導(dǎo)氯霉素類和林可酰胺類抗生素耐藥機(jī)制中還伴有核苷酸C2498位甲基化的抑制作用。目前攜帶該耐藥基因的質(zhì)粒多見于動(dòng)物葡萄球菌、腸球菌分離株[26]。

4.2.1.2cfr(B)分型 2015年美國(guó)首次報(bào)道了從臨床屎腸球菌分離株中發(fā)現(xiàn)的新cfr基因型——cfr(B)基因，和先前已知的葡萄球菌和非屎腸球菌類腸球菌cfr編碼的氨基酸序列相比較，它們的同源性僅有74.9%。該基因是通過(guò)整合在轉(zhuǎn)座子Tn6218上在屎腸球菌以及艱難梭菌間傳播，有可能造成大范圍的傳播[27]。但是關(guān)于含有此基因亞型腸球菌屬的耐藥水平需進(jìn)一步確認(rèn)。

4.2.2optrA基因 2015年報(bào)道了新的可導(dǎo)致對(duì)利奈唑胺耐藥的基因——optrA基因，該基因具有可轉(zhuǎn)移性，可通過(guò)質(zhì)粒傳播[28]。optrA基因編碼ABC家族F亞家族蛋白。ABC超家族可分為3類，前兩類外向轉(zhuǎn)運(yùn)子及內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)子參與轉(zhuǎn)運(yùn)，第三類則現(xiàn)mRNA的翻譯和DNA的修復(fù)有關(guān)[29]。經(jīng)典的ABC超家族主要由跨膜區(qū)（transmembrane domain，TMD）和ATP結(jié)合域（nucleotide-binding domain，NBD）組成。而ABC-F家族組成缺乏跨膜區(qū)，僅有ATP結(jié)合域。以往關(guān)于該家族導(dǎo)致耐藥的機(jī)制有兩種假說(shuō)，一是經(jīng)典外排效應(yīng)，通過(guò)ATP水解釋放能量，細(xì)胞內(nèi)藥物通過(guò)跨膜區(qū)被轉(zhuǎn)運(yùn)出去。二是核糖體保護(hù)機(jī)制，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制藥物與核糖體結(jié)合，從而降低胞內(nèi)的藥物濃度。2016年有研究通過(guò)對(duì)該家族基因vga(A)、lsa(A)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯實(shí)驗(yàn)及核糖體藥物結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該家族導(dǎo)致耐藥的機(jī)制更傾向于后者[30]。此外近些年又不斷發(fā)現(xiàn)了一些optrA基因變異型，其中EYDD型（發(fā)生三處氨基酸改變：Lys3Glu、Asn12Tyr、Tyr176Asp）可使金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的利奈唑胺MIC升高2～8倍[31]。但利奈唑胺MIC中介及敏感菌株中也存在此基因，其耐藥性的發(fā)生可能和其他機(jī)制有協(xié)同作用，或者有某種機(jī)制導(dǎo)致該基因低表達(dá)等，具體機(jī)制如何有待深入研究。

在研究耐藥機(jī)制的同時(shí)，有實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較利奈唑胺敏感與耐藥/中介腸球菌，發(fā)現(xiàn)耐藥者具有更厚的生物膜。而且通過(guò)透射電子顯微鏡觀察，利奈唑胺耐藥或中介的腸球菌細(xì)胞壁往往比敏感者更厚[32]。生物膜是否參與耐藥形成有待進(jìn)一步探究。

腸球菌是重要的條件致病菌，耐藥機(jī)制復(fù)雜。近些年來(lái)，利奈唑胺作為有效的抗菌藥物在臨床得到廣泛使用，因?yàn)槟退幘瓴粩嘣龆嘁约靶滦湍退幘甑某霈F(xiàn)，使得臨床對(duì)腸球菌感染的預(yù)防與治療變得更加棘手。對(duì)利奈唑胺等新型藥物耐藥的臨床分離株過(guò)快出現(xiàn)，也提示需要嚴(yán)格控制使用此類藥物。此外，新耐藥機(jī)制的發(fā)現(xiàn)也使得未來(lái)利奈唑胺應(yīng)用于臨床治療革蘭陽(yáng)性球菌感染受到挑戰(zhàn)，且不排除其他新的耐藥機(jī)制存在。在加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)的同時(shí)也應(yīng)開展相關(guān)耐藥新機(jī)制的研究。

[1] OFFERMANNS S， ROSENTHAL W. Penicillin binding protein[M]. Encyclopedia Mol Pharmacol， 2008 ：936.

[2] 胡付品， 朱德妹， 汪復(fù)， 等. 2015年 CHINET 細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2016，16（6）：685-694.

[3] 胡付品， 朱德妹， 汪復(fù)， 等. 2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2015，15（5）：401-410.

[4] 胡付品， 朱德妹， 汪復(fù)， 等. 2013年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2014，14（5）：365-374.

[5] 汪復(fù)， 朱德妹， 胡付品， 等. 2012年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2013，13（5）：321-330.

[6] 胡付品， 朱德妹， 汪復(fù)， 等. 2011年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2012，12（5）：321-329.

[7] 朱德妹， 汪復(fù)， 胡付品， 等. 2010年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2011，11（5）：321-329.

[8] 汪復(fù)， 朱德妹， 胡付品， 等. 2009年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2010，10（5）：325-334.

[9] 汪復(fù)， 朱德妹， 胡付品， 等. 2008年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2009，9（5）：321-329.

[10] 汪復(fù)， 朱德妹， 胡付品， 等. 2007年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2008，8（5）：325-333.

[11] 汪復(fù). 2006年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2008，8（1）：1-9.

[12] 汪復(fù). 2005中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2006，6（5）：289-295.

[13] 胡付品， 朱德妹， 汪復(fù)， 等. 2016年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2017，17（5）：481-491.

[14] KLOSS P， XIONG L， SHINABARGER DL， et al. Resistance mutations in 23 S rRNA identify the site of action of the protein synthesis inhibitor linezolid in the ribosomal peptidyl transferase center[J]. J Mol Biol， 1999，294（1）：93-101.

[15] LONG KS， VESTER B. Resistance to linezolid caused by modifications at its binding site on the ribosome[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2012，56（2）：603.

[16] SHINABARGER DL， MAROTTI KR， MURRAY RW， et al.Mechanism of action of oxazolidinones： effects of linezolid and eperezolid on translation reactions[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1997，41（10）：2132-2136.

[17] HAMEL JC， STAPERT D， MOERMANN JK， et al. Linezolid，critical characteristics[J]. Infection， 2000，28（1）：60-64.

[18] MACGOWAN AP. Pharmacokinetic and pharmacodynamic profile of linezolid in healthy volunteers and patients with Grampositive infections[J]. J Antimicrob Chemother， 2003，51（Suppl 2）：i17-i25.

[19] PRYSTOWSKY J， SIDDIQUI F， CHOSAY J， et al. Resistance to linezolid： characterization of mutations in rRNA and comparison of their occurrences in vancomycin-resistant enterococci[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001，45（7）：2154.

[20] WILSON P， ANDREWS JA， CHARLESWORTH R， et al.Linezolid resistance in clinical isolates ofStaphylococcus aureus[J]. J Antimicrob Chemother， 2003，51（1）：186-188.

[21] 席瑞， 田素飛， 褚云卓， 等. 利奈唑胺體外誘導(dǎo)腸球菌耐藥及耐藥機(jī)制研究[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2011，11（1）：22-26.

[22] LOCKE JB， HILGERS M， SHAW KJ. Mutations in ribosomal protein l3 are associated with oxazolidinone resistance in staphylococci of clinical origin[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009，53（12）：5275-5278.

[23] TAMANG MD， MOON DC， KIM SR， et al. Detection of novel oxazolidinone and phenicol resistance gene optrA in enterococcal isolates from food animals and animal carcasses[J]. Veterinary Microbiol， 2017，201 ：252-256.

[24] DIAZ L， KIRATISIN P， MENDES RE， et al. Transferable plasmid-mediated resistance to linezolid due to cfr in a human clinical isolate ofEnterococcus faecalis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2012，56（7）：3917-3922.

[25] ATKINSON GC， HANSEN LH， TENSON T， et al. Distinction between the Cfr methyltransferase conferring antibiotic resistance and the housekeeping RlmN methyltransferase[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2013，57（8）：4019-4026.

[26] LONG KS， POEHLSGAARD J， KEHRENBERG C， et al. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols， Lincosamides， Oxazolidinones， Pleuromutilins， and Streptogramin A Antibiotics[J]. Antimicrob Agents Chemother，2006，50（7）：2500-2505.

[27] DESHPANDE LM， ASHCRAFT DS， KAHN HP， et al.Detection of a new cfr-like gene， cfr（B）， inEnterococcus faeciumisolates recovered from human specimens in the United States as Part of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2015，59（10）：6256-6261.

[28] WANG Y， LV Y， CAI J， et al. A novel gene， optrA， that confers transferable resistance to oxazolidinones and phenicols and its presence inEnterococcus faecalisandEnterococcusfaeciumof human and animal origin[J]. J Antimicrob Chemother， 2015，70（8）：2182-2190.

[29] DAVIDSON AL， DASSA E， ORELLE C， et al. Structure，function， and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2008，72（2）：317-364.

[30] SHARKEY LK， EDWARDS TA， O NEILL AJ. ABC-F proteins mediate antibiotic resistance through ribosomal protection[J].MBio， 2016，7（2）：e01975.

[31] CUI L， WANG Y， LV Y， et al. Nationwide surveillance of novel oxazolidinone resistance gene optra inEnterococcusisolates in China from 2004 to 2014[J]. Antimicrob Agents Chemother，2016，60（12）：7490.

[32] CAI JC， HU YY， ZHANG R， et al. Linezolid-resistant clinical isolates of meticillin-resistant coagulase-negative staphylococci andEnterococcus faeciumfrom China[J]. J Med Microbiol，2012，61（11）：1568-1573.