三醇皂苷中人參皂苷Rg1的分離純化工藝研究

李瀅 張敏 高宏濤

摘要：目的 優(yōu)選三醇皂苷中高純度人參皂苷Rg1的中壓制備工藝條件。方法 采用反相C18色譜中壓制備方法，以人參皂苷Rg1的純度及收率為指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果 C18色譜柱徑高比為1：3.25，以20%乙醇上樣0.2倍柱體積的三醇皂苷、以8 BV/h 的洗脫流速用30%、30%-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個(gè)柱體積，濃縮得人參皂苷Rg1粗品，加入4倍體積的95%乙醇溶解，之后加入0.5%的活性炭熱回流40 min，干燥得人參皂苷Rg1精品。結(jié)論 經(jīng)純化后可以從三醇皂苷中分離得到純度高于99.5%的人參皂苷Rg1。本文首次提供了純度高于99.5%的人參皂苷Rg1的中壓制備工藝，經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證該工藝穩(wěn)定可行且重復(fù)性好，可用于工業(yè)化放大生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：三醇皂苷；人參皂苷Rg1；純化工藝

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2018）11-0069-03

【Abstract】Objective： To optimize the medium pressure preparation process conditions of high purity ginsenoside Rg1 in triol saponins. Methods： The reversed-phase C18 chromatographic preparation method was used to investigate the purity and yield of ginsenoside Rg1. Results： The diameter-to-height ratio of C18 column was 1：3.25. The triol saponin of 0.2 times column volume loaded with 20% ethanol and the elution flow rate with 30%， 30%-40%， 40% ethanol were separately eluted to 1， 3， 0.5 column volumes at 8 BV/h. The crude ginsenoside Rg1 was concentrated and dissolved in 4 volumes of 95% ethanol. Then， 0.5% activated carbon was heated and refluxed for 40 min， and dried to obtain good quality higinsenoside Rg1. Conclusion： After purification， ginsenoside Rg1 with purity higher than 99.5% can be isolated from triol saponin. This medium-pressure preparation process of ginsenoside Rg1 with purity higher than 99.5% is provided for the first time. It has been proved by many experiments that the process is stable， feasible and reproducible， and can be used for industrial scale-up production.

【Key words】triol saponin， ginsenoside Rg1， purification process

三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根莖，由于其具有顯著的止血化瘀作用，三七及其提取物在心腦血管治療及預(yù)防方面均在國(guó)際市場(chǎng)占有一席之地。皂苷是三七的主要有效成分之一，研究表明，人參皂苷Rg1占三七總皂苷量的20%，且具有抗焦慮、抗癲癇[1]、改善阿爾茲海默癥認(rèn)知能力[2]、減少缺血性/再灌注心律失常的發(fā)生率及心肌梗死面積[3]、治療肌萎縮等藥理作用[4]，這使其在防治心腦血管疾病方面具有極大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)采用單因素多水平試驗(yàn)，以人參皂苷Rg1的純度及收率為指標(biāo)，優(yōu)選出了人參皂苷Rg1的最佳反相（C18硅膠色譜）中壓制備工藝條件。本研究提供了純度高于99.5%的人參皂苷Rg1純化工藝，為人參皂苷Rg1的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 美國(guó)戴安U3000型高效液相色譜儀；梅特勒XP-205 型分析天平；Ulupure 超純水制備系統(tǒng)（成都超純）；日本山善株式會(huì)社YFLC-AI-700中低壓制備色譜。

1.2 材料 人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-201529）中國(guó)食品藥品檢定研究院；三醇皂苷（批號(hào)：2015003）昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院自制；C18反相硅膠（蘇州納微科技有限公司）；安捷倫Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；甲醇、乙腈均為色譜純（德國(guó)默克公司）；甲醇、乙醇為分析純；全部實(shí)驗(yàn)用水均為超純水制造系統(tǒng)制備的電阻率大于 18.25 MΩ·cm的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定三七總皂苷對(duì)照提取物適量，加70%甲醇溶液制成每1 mL含2.5 mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品25 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：安捷倫Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl；理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

2.2 三醇皂苷中人參皂苷Rg1的分離

2.2.1 人參皂苷Rg1純化條件的篩選 取反相C18色譜柱（50 μm，20*250 mm），采用中低壓制備色譜儀，考察乙醇濃度在20-45%之間梯度洗脫所得有效成分人參皂苷Rg1的純度及收率。分別上樣2 g三醇皂苷（人參皂苷Rg1含量：1.12 mg/mL），洗脫梯度如下表2～5，結(jié)果見(jiàn)表6。

從試驗(yàn)結(jié)果可知，條件2洗脫所得人參皂苷Rg1純度最高，但收率較低，僅有76.70%；條件4洗脫所得人參皂苷Rg1收率最大，且純度較高為89.88%，與條件2洗脫最高純度90.25%相差不大，因此選擇條件4作為最適洗脫條件。

2.2.2 上樣量的選擇 取反相C18色譜柱（50 μm，20*65 mm，20 mL），分別上樣2（0.1 BV）、3（0.15 BV）、4（0.2 BV）g，以20%乙醇上樣、30%、30-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個(gè)柱體積，檢測(cè)洗脫液中人參皂苷Rg1的純度，篩選出最優(yōu)上樣量。結(jié)果見(jiàn)表7。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)上樣4（0.2 BV）g時(shí)，分離得到的人參皂苷Rg1的純度及收率均最高，因此選擇上樣4（0.2 BV）g為最適上樣量。

2.2.3 洗脫流速的選擇 取反相C18色譜柱（50 μm，20*65 mm，20 mL），上樣4（0.2 BV）g，以20%乙醇上樣、30%、30-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個(gè)柱體積，洗脫流速分別為6、7、8 BV/h。測(cè)定洗脫液中人參皂苷Rg1的純度，結(jié)果見(jiàn)表8。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著洗脫流速的增加，洗脫液中人參皂苷Rg1的純度不斷降低，但收率不斷升高，洗脫流速8 BV/h所得人參皂苷Rg1收率最高，且純度較7 BV/h洗脫所得相差不大，因此選擇洗脫流速8 BV/h作為最適洗脫流速。

2.2.4 精制條件的篩選 通過(guò)之前的試驗(yàn)可以獲得純度為90%左右的人參皂苷Rg1粗品，擬采用活性炭精制的方法以獲得純度高于99%的人參皂苷Rg1。

2.2.4.1 溶劑倍數(shù)的選擇 取100 mL三角瓶4個(gè)，各加入5 g的人參皂苷Rg1粗品，之后分別加入20、30、40、50 mL的95%乙醇，60 ℃水浴溶解，記錄溶解所需時(shí)間，見(jiàn)有9。

從上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出，20 mL（4倍體積）95%乙醇溶解人參皂苷Rg1粗品用時(shí)最短，因此選擇4倍95%乙醇作為最優(yōu)溶解溶劑。

2.2.4.2 加活性炭量的選擇 取100 mL三角瓶3個(gè)，各加入5 g的人參皂苷Rg1粗品，加入20 mL（4倍體積）95%乙醇，60 ℃水浴溶解，之后分別加入0.3%、0.5%、1%的活性炭，70 ℃水浴回流30 min，趁熱過(guò)濾，濾液減壓回收溶劑，測(cè)定人參皂苷Rg1純度，見(jiàn)表10。

從上表可以看出，選取人參皂苷Rg1純度及收率最高的實(shí)驗(yàn)條件，即加活性炭0.5%為最優(yōu)加活性炭的量。

2.2.4.3 回流時(shí)間的選擇 取100 mL三角瓶5個(gè)，各加入5 g的人參皂苷Rg1粗品，加入20 mL（4倍體積）95%乙醇，60 ℃水浴溶解，加入0.5%活性炭，70 ℃水浴分別回流10、20、30、40、60 min，趁熱過(guò)濾，濾液減壓回收溶劑，測(cè)定人參皂苷Rg1純度，見(jiàn)表11。

從表中可以看出，回流60 min所得人參皂苷Rg1純度及收率均最高，但與回流40 min所得人參皂苷Rg1純度及收率相比相差不大，且節(jié)約了時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本，因此選取回流40 min為最優(yōu)條件。

2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 取反相C18色譜柱（200 mL，徑高比為1：3.25）上樣40 g（0.2 BV），之后以20%乙醇上樣、以8 BV/h 的洗脫流速用30%、30-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個(gè)柱體積，濃縮得人參皂苷Rg1粗品，加入4倍體積的95%乙醇溶解，之后加入0.5%的活性炭熱回流40 min，得人參皂苷Rg1精品，測(cè)量其純度。結(jié)果見(jiàn)表12。

試驗(yàn)結(jié)果表明，該純化工藝可以將三醇皂苷中的色素及Rb1有效剔除，通過(guò)精制工藝之后得到的人參皂苷Rg1純度在99.5%以上，且轉(zhuǎn)移率大于90%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

本研究首次提供了純度99.5%以上的人參皂苷Rg1的分離純化工藝。通過(guò)對(duì)比不同工藝參數(shù)，以人參皂苷Rg1的純度及轉(zhuǎn)移率為標(biāo)準(zhǔn)，確定了人參皂苷Rg1反相C18色譜中壓制備純化工藝條件為：反相C18色譜柱徑高比為1：3.25，以20%乙醇上樣、以8 BV/h 的洗脫流速以20%乙醇上樣、30%、30-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個(gè)柱體積，濃縮得人參皂苷Rg1粗品，加入4倍體積的95%乙醇溶解，之后加入0.5%的活性炭熱回流40 min，得人參皂苷Rg1精品。

經(jīng)驗(yàn)證，采用C18色譜中壓制備分離純化技術(shù)，可有效從三醇皂苷中分離得到純度高于99.5%的人參皂苷Rg1，該工藝條件及參數(shù)可行且重復(fù)性好，可用于進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)，為其進(jìn)一步研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為其臨床用藥價(jià)值提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

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