氣相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS方法和分散液液微萃取技術(shù)測(cè)定茭白中三唑類農(nóng)藥殘留

, , , , , ,

(浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院, 杭州 310014)

茭白是生長(zhǎng)于淺水的多年水生草本植物,是我國(guó)特有水生蔬菜之一,含有多種豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸,以豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而被譽(yù)為“水中參”,質(zhì)地鮮嫩,味甘實(shí),被視為蔬菜中的佳品。近年來(lái),茭白產(chǎn)業(yè)發(fā)展非常迅速。三唑類農(nóng)藥是一種新型的殺菌劑,不僅具有內(nèi)吸殺菌活性,還具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的作用,在蔬菜、水果中應(yīng)用廣泛[1];同時(shí)三唑類農(nóng)藥也是防治茭白銹病、胡麻葉斑病和灰心斑病的常用農(nóng)藥[2-4]。但部分農(nóng)戶對(duì)農(nóng)藥的合理使用觀念相對(duì)缺乏,農(nóng)藥亂用和濫用情況較為嚴(yán)重,除了直接使用農(nóng)藥之外,茭白等水生蔬菜易從土壤和水體環(huán)境中吸收污染物并富集[5]。因此,建立簡(jiǎn)單快速地測(cè)定茭白中三唑類農(nóng)藥殘留的分析方法具有重要意義。

目前,關(guān)于蔬菜和水果中三唑類農(nóng)藥殘留的分析檢測(cè)已有較多的報(bào)道[6-11],然而關(guān)于茭白的文獻(xiàn)大多涉及生物特性領(lǐng)域[12-14],農(nóng)藥殘留方向報(bào)道的文獻(xiàn)較少,主要有酶速測(cè)方法[15]和固相萃取法(SPME)[16]。本工作采用QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)法結(jié)合基于巴斯德吸管的分散液液微萃取技術(shù)(DLLME)對(duì)茭白中的腈菌唑、戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑等3種三唑類農(nóng)藥進(jìn)行萃取濃縮,并進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)分析。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

GC 2000-Mars 6100型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;AL 204型電子分析天平;SY-360型超聲波清洗器;Vortex Genius 3型渦旋混勻器;5 mL巴斯德吸管。

腈菌唑純度不小于97%,戊唑醇純度不小于96.5%,氟環(huán)唑純度不小于97%,苯醚甲環(huán)唑純度不小于96%;甲苯、正己烷、環(huán)己烷、乙腈、氯化鈉、硫酸鈉和無(wú)水硫酸鎂為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

1) 色譜條件 DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣為氦氣(純度99.999%),流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣口溫度280 ℃;不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量1.0 μL,0.75 min后以20 mL·min-1進(jìn)行載氣吹掃。升溫程序:起始溫度180 ℃,保持1 min;然后以5 ℃·min-1速率升溫至200 ℃,保持1 min;之后以2 ℃·min-1速率升溫至220 ℃;最后以10 ℃·min-1速率升至290 ℃,保持6 min。

2) 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子阱溫度180 ℃;歧管溫度為50 ℃;傳輸線溫度250 ℃;掃描速率3 scans·s-1;溶劑延遲3 min。采用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式,各化合物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1,*為內(nèi)標(biāo)。

缼齒蓑蘚106份樣本的13個(gè)形態(tài)性狀見(jiàn)附表。106份樣本6個(gè)數(shù)量性狀的變異情況見(jiàn)表3。從表3可看出，缺齒蓑蘚6個(gè)數(shù)量性狀在不同的樣本間存在一定的變異，變異程度在18.01% ～ 24.02%。6個(gè)數(shù)量性狀的變異系數(shù)從大到小依次為：下部細(xì)胞長(zhǎng)寬比、葉上部長(zhǎng)寬比、葉長(zhǎng)、葉下部長(zhǎng)寬比、葉中部長(zhǎng)寬比和中肋粗細(xì)。

1．3 試驗(yàn)方法

將茭白樣品擦洗干凈,取可食用部分切成小塊,置于榨汁機(jī)中勻漿,勻漿好的樣品存儲(chǔ)于4 ℃的冰箱中。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab. 1 MS parameters

QuEChERS凈化步驟:稱取勻漿好的茭白樣品3.000 g于帶蓋的離心管中,加入內(nèi)標(biāo)物氟環(huán)唑(在茭白中的質(zhì)量比為100 μg·kg-1),加入乙腈3 mL,超聲提取1 min;隨后加入無(wú)水硫酸鎂0.8 g和氯化鈉0.5 g,渦旋30 s后,于5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心3 min;接著取出上層乙腈層,轉(zhuǎn)移至事先裝有30 mgN-丙基乙二胺(PSA)和30 mg C18的離心管中,繼續(xù)渦旋30 s后,于5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心3 min。

DLLME步驟:移取QuEChERS凈化后的上層乙腈萃取物800 μL于改造過(guò)的4.5 mL巴斯德吸管中,加入甲苯30 μL,混合均勻,快速注入水2.5 mL,在水浴中超聲輔助萃取45 s后形成乳濁液,然后在5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心3 min;離心結(jié)束后輕輕擠壓巴斯德吸管使上層甲苯相進(jìn)入窄口徑處,用微量進(jìn)樣針抽取上層甲苯相(12±1) μL至0.5 mL聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)薄壁管(PCR)中,加入少量無(wú)水硫酸鈉除去有機(jī)相中微量水分,抽取1 μL注入GC-MS中分析檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

空白茭白樣品中加標(biāo)的總離子流圖見(jiàn)圖1。

1-腈菌唑;2-戊唑醇;3-氟環(huán)唑;4-苯醚甲環(huán)唑圖1 空白茭白樣品加標(biāo)后的總離子流圖Fig. 1 TIC chromatogram of spiked Zizania latifolia sample

2．2 QuEChERS試驗(yàn)條件的選擇

2．2．1 提取方式及提取時(shí)間

試驗(yàn)選取乙腈作為QuEChERS步驟的萃取溶劑,為使得分析物能快速充分萃取到乙腈中,考察了渦旋輔助提取和超聲輔助提取兩種方式對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果表明在相同提取時(shí)間的情況下超聲輔助提取效果更好。

一般來(lái)說(shuō),提取時(shí)間越長(zhǎng),提取越充分,但時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)造成提取劑的蒸發(fā)損失。試驗(yàn)考察了超聲時(shí)間分別為0.50,0.75,1.0,2.0,5.0 min時(shí)的提取效果,結(jié)果見(jiàn)圖2。

1-腈菌唑;2-戊唑醇;3-苯醚甲環(huán)唑圖2 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the extraction efficiency

由圖2可知:3種三唑類農(nóng)藥的峰面積隨著超聲時(shí)間增加而增加;當(dāng)超聲時(shí)間大于1.0 min時(shí),峰面積基本保持穩(wěn)定。試驗(yàn)選擇提取時(shí)間為1.0 min。

2．2．2 吸附劑類型及其用量

試驗(yàn)考察了PSA、C18、PSA-C18混合物等3類吸附劑的凈化效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn):只用PSA凈化時(shí),溶液顏色呈現(xiàn)淡黃色;只用C18凈化時(shí),雜質(zhì)響應(yīng)較高從而降低了目標(biāo)物的響應(yīng)。試驗(yàn)選擇質(zhì)量比為1∶1的PSA-C18混合吸附劑。

試驗(yàn)考察了吸附劑的用量對(duì)凈化效果的影響,見(jiàn)圖3。

1-腈菌唑;2-戊唑醇;3-苯醚甲環(huán)唑圖3 吸附劑用量對(duì)凈化效果的影響Fig. 3 Effect of amount of adsorbents on the purification efficiency

由圖3可知:當(dāng)吸附劑用量為20 mg時(shí),萃取效果較好,但此時(shí)溶液顏色呈現(xiàn)淡黃色;而當(dāng)吸附劑量增加60 mg時(shí),雖然峰面積有所下降,但溶液呈澄清透明;隨著吸附劑量的繼續(xù)增加,溶液顏色皆為澄清透明而峰面積略有下降直至穩(wěn)定,可能是因?yàn)槲絼?duì)目標(biāo)物也進(jìn)行了一定程度的吸附。綜合考慮溶液顏色及吸附效果,試驗(yàn)選擇30 mg PSA與30 mg C18為吸附劑。

2．3 DLLME試驗(yàn)條件的選擇

2．3．1 萃取劑及其用量

萃取劑在DLLME過(guò)程中直接影響目標(biāo)物的萃取效率。試驗(yàn)采用甲苯、環(huán)己烷、正己烷等低密度溶劑作為萃取劑進(jìn)行優(yōu)化。其中,上述3種萃取劑在收集到相同體積上層有機(jī)相(11±1) μL時(shí)所用體積分別為40,70,80 μL。綜合考慮萃取劑的用量及萃取效率,試驗(yàn)選擇甲苯作為萃取劑。

萃取劑使用量少,可獲得較高的富集倍數(shù)和減少對(duì)環(huán)境的污染,但同時(shí)需確保有足夠的上層有機(jī)相以便于收集。試驗(yàn)考察了甲苯體積分別為25,30,35,40,45 μL時(shí)對(duì)萃取結(jié)果的影響。結(jié)果表明:當(dāng)甲苯體積為25 μL時(shí),所得到的上層有機(jī)相體積較少,不便于收集;當(dāng)甲苯體積大于30 μL時(shí),峰面積隨著甲苯體積的增加而逐漸減小,這是因?yàn)殡S著甲苯體積的增大,稀釋作用占主導(dǎo)作用。綜合考慮,試驗(yàn)選擇甲苯體積為30 μL。

2．3．2 分散劑用量

乙腈萃取物在DLLME過(guò)程中作為待測(cè)定的提取樣品(其中的乙腈又作為DLLME的分散劑),分散劑的用量直接影響“水/乙腈/甲苯乳濁液”體系的形成:如果分散劑的用量少,不能很好地將萃取劑分散,也不能完全形成乳濁液或者乳化不完全;若分散劑的用量過(guò)多,則萃取劑在水中的溶解度增加從而使萃取效率降低;同時(shí),分散劑的體積是影響富集倍數(shù)及儀器響應(yīng)的重要參數(shù)。試驗(yàn)選取600,800,1 000,1 200,1 400 μL的乙腈萃取物進(jìn)行考察。結(jié)果表明:當(dāng)乙腈萃取物體積為600 μL時(shí),所得到的上層有機(jī)相很少,幾乎無(wú)法取出;當(dāng)乙腈萃取物體積大于800 μL時(shí),峰面積隨著乙腈萃取物體積的增大而逐漸減小。試驗(yàn)選擇乙腈萃取物的體積為800 μL。

2．3．3 萃取時(shí)間

超聲能加速目標(biāo)分析物從水相到萃取相的質(zhì)量傳遞,同時(shí)還能減小萃取劑微滴的尺寸來(lái)增加萃取相與水相的接觸面積,從而提高萃取效率。超聲時(shí)間過(guò)短,萃取劑沒(méi)有完全形成細(xì)小的顆粒均勻地分散在水相溶液中,乳化作用不充分。超聲波的機(jī)械作用和熱效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致萃取劑的揮發(fā)損失,有機(jī)相的體積會(huì)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而減小。因此在保證最佳萃取效率的基礎(chǔ)上還要考慮上層有機(jī)相的體積。試驗(yàn)考察了超聲時(shí)間分別為15,30,45,60,75 s時(shí)的萃取效果,結(jié)果表明:開(kāi)始3種三唑類農(nóng)藥的峰面積隨著超聲時(shí)間增加而有所增加;當(dāng)超聲時(shí)間大于45 s時(shí),峰面積隨超聲時(shí)間增加而減小。綜合考慮,試驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為45 s。

2．3．4 水的體積

試驗(yàn)中水相的作用是除去水溶性高沸點(diǎn)雜質(zhì)和以分散微萃取的方式富集待測(cè)定的目標(biāo)物,以提高方法的靈敏度。試驗(yàn)選擇1.0,1.5,2.0,2.5,2.8 mL水進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)水的體積從1.0 mL逐漸增大至2.5 mL時(shí),峰面積呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì);而當(dāng)水的體積繼續(xù)增大時(shí),峰面積有所減小。試驗(yàn)選擇水的體積為2.5 mL。

2．4 工作曲線與檢出限

分別對(duì)腈菌唑、戊唑醇質(zhì)量比為5.0,10.0,20.0,50.0,100,200,500 μg·kg-1,苯醚甲環(huán)唑質(zhì)量比為12.5,25.0,50.0,125,250,500,1 250 μg·kg-1的空白茭白加標(biāo)樣品,在優(yōu)化的條件下進(jìn)行萃取,再進(jìn)行GC-MS分析,以3種三唑類農(nóng)藥的峰面積與內(nèi)標(biāo)物(氟環(huán)唑質(zhì)量比為100 μg·kg-1)峰面積的比值(y)對(duì)質(zhì)量比(x)繪制工作曲線,線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

分別以3倍信噪比和10倍信噪比作為檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab. 2 Linearity parameters, detection limits and lower limits of determination

2．5 精密度與回收試驗(yàn)

選用空白茭白為基質(zhì),加入不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使腈菌唑、戊唑醇質(zhì)量比為20,100,200 μg·kg-1,苯醚甲環(huán)唑質(zhì)量比為50,250,500 μg·kg-1,按試驗(yàn)方法進(jìn)行前處理后,平行測(cè)定5次,計(jì)算加標(biāo)回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab. 3 Results of tests for precision and recovery(n=5)

由表3可知:3種三唑類農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在82.7%～116%之間,RSD在4.1%～15%之間。

2．6 樣品分析

從浙江某農(nóng)場(chǎng)獲得8個(gè)陽(yáng)性茭白樣品(在茭白種植過(guò)程中,定期施用3種三唑類農(nóng)藥后采集到的在不同施藥時(shí)間下的茭白樣品),按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。8個(gè)茭白樣品中均檢出3種三唑類農(nóng)藥殘留,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明,該方法適用于實(shí)際茭白樣品的分析檢測(cè)。

本工作采用QuEChERS-DLLME結(jié)合GC-MS分析方法用于測(cè)定茭白樣品中三唑類農(nóng)藥殘留。采用聚乙烯材質(zhì)的一次性巴斯德吸管為萃取裝置,避免了交叉污染;使用密度小于水的甲苯為萃取劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)分散液液微萃取中高毒性的萃取劑,降低了對(duì)環(huán)境和人體的傷害;將QuEChERS凈化方法與DLLME技術(shù)結(jié)合,既對(duì)樣品基質(zhì)進(jìn)行凈化操作,又對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行富集濃縮。該方法重復(fù)性良好,檢出限低,成功應(yīng)用于茭白實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表4 樣品中3種三唑類農(nóng)藥的測(cè)定結(jié)果Tab. 4 Determination results of 3 triazole pesticides in samples μg·kg-1

[1] 周子燕,李昌春,高同春,等.三唑類殺菌劑的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008,36(27):11842-11844．

[2] 陳建明,丁新天,潘遠(yuǎn)勇,等.4種殺菌劑對(duì)茭白銹病的防治效果[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013(11):1463-1465．

[3] 葉琪明,顧國(guó)平,李建榮,等.茭白銹病和胡麻斑病的發(fā)生規(guī)律及其無(wú)害化防治[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2003,15(3):144-148．

[4] 汪愛(ài)娟,戴德江,李阿根,等.茭白胡麻斑病藥劑防治技術(shù)研究[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊, 2016,36(1):68-70．

[5] 楊蘭,楊慧,王富華,等.水生蔬菜中主要污染物風(fēng)險(xiǎn)項(xiàng)目分析研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013,55(22):5577-5580．

[6] 盧亞玲,賈清華,肖加加,等.固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定果蔬中36種農(nóng)藥[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè), 2015,51(6):828-832．

[7] 程盛華,張利強(qiáng),魏曉奕,等.固相萃取-在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中53種農(nóng)藥殘留量[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè), 2015,51(2):146-152．

[8] 王璐,羅銘,賀澤英,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大蒜中40種農(nóng)藥殘留[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè), 2015,51(12):1702-1707．

[9] BORDAGARAY A, GARCIA-ARRONA R, MILLN E. Determination of triazole fungicides in liquid samples using ultrasound-assisted emulsification microextraction with solidification of floating organic droplet followed by high-performance liquid chromatography[J]. Food Analytical Methods, 2014,7(6):1195-1203．

[10] FARAJZADEH M A, SHEYKHIZADEH S, KHORRAM P. Extraction and preconcentration of some triazole pesticides in grape juice by salting out homogeneous liquid-liquid extraction in a narrow-bore tube prior to their determination by gas chromatography-flame ionization detection[J]. Food Analytical Methods, 2014,7(6):1229-1237．

[11] GOLGE O, KABAK B. Determination of 115 pesticide residues in oranges by high-performance liquid chromatography-triple-quadrupole mass spectrometry in combination with QuEChERS method[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2015,41:86-97．

[12] FAN J, SHI M, HUANG J Z, et al. Regulation of photosynthetic performance and antioxidant capacity by (60)Coγ-irradiation in Zizania latifolia plants[J]. Journal of Environmental Radioactivity, 2014,129:33-42．

[13] ZHANG X K, WAN A, WANG H L, et al. The overgrowth of Zizania latifolia in a subtropical floodplain lake: changes in its distribution and possible water level control measures[J]. Ecological Engineering, 2016,89:114-120．

[14] YAN N, WANG X Q, XU X F, et al. Plant growth and photosynthetic performance of Zizania latifolia are altered by endophytic Ustilago esculenta infection[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 2013,83:75-83．

[15] 劉云霞.茭白中農(nóng)藥殘留酶速測(cè)法假陽(yáng)性消除研究[J].農(nóng)民致富之友, 2013(6):120-120．

[16] 喻磊.固相微萃取在水生蔬菜農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014．