軟組織肉瘤表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展*

軟組織肉瘤是起源于原始間充質(zhì)干細(xì)胞的一組全能型腫瘤，可分化成不同的間葉細(xì)胞系［1-2］。軟組織肉瘤亞組眾多，在最新公布的WHO軟組織腫瘤分類中，軟組織肉瘤分為11個(gè)亞組，此分類受到包括基因組變化及表觀遺傳學(xué)改變?cè)趦?nèi)的分子生物學(xué)的影響。目前與腫瘤相關(guān)的表觀遺傳IP機(jī)制主要有4種類型：DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNA和其他非編碼RNA的調(diào)控、染色體重塑。近年關(guān)于軟組織肉瘤表觀遺傳學(xué)改變的研究日益增加，這些研究的開展為治療提供了很多新的生物靶點(diǎn)，一些新型藥物也處于臨床試驗(yàn)當(dāng)中。本文就當(dāng)前關(guān)于表觀遺傳改變導(dǎo)致軟組織肉瘤發(fā)生、發(fā)展的研究進(jìn)行綜述，并討論其在臨床診斷與治療中的潛在意義。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是DNA分子加入甲基的過程，在人類細(xì)胞中，甲基化一般發(fā)生在CpG雙核苷酸上，通過添加甲基至胞嘧啶環(huán)的5'碳上形成5-甲基胞嘧啶。CpG二核苷酸在基因序列中約占70%～90%，并且常發(fā)生DNA甲基化來(lái)介導(dǎo)相關(guān)基因失活。CpG二核苷酸富集的區(qū)域稱為CpG島，約占整個(gè)基因序列的1%。CpG島常出現(xiàn)在真核生物編碼基因的調(diào)控區(qū)，并且在正常情況下處于非甲基化狀態(tài)。目前有研究發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)DNA甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有3種：DN?MT1、DMNT3A和DNMT3B［3］，同時(shí)也有3種可以將5-甲基胞嘧啶脫甲基的酶，其被稱為TET（ten-eleven translocation）蛋白，TET蛋白可以將5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶，從而逆轉(zhuǎn)基因的抑制狀態(tài)。在人類腫瘤中普遍存在全基因組低甲基化、正常狀態(tài)下非甲基化CpG島的異常高甲基化和維持甲基化模式酶調(diào)節(jié)失控的現(xiàn)象，但是其復(fù)雜的分子機(jī)制目前尚未研究透徹。在軟組織肉瘤中，DNA高甲基化所致的抑癌基因失活可以誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。以磷酸酶-張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）為例，有研究表明在軟組織肉瘤患者中PTEN存在異常的甲基化，其CpG位點(diǎn)發(fā)生超甲基化后可導(dǎo)致PTEN基因失活，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞分裂失控，這種異常甲基化就有作為軟組織肉瘤的潛在候選生物標(biāo)志物的可能［4］。Mahoney等［5］在小兒橫紋肌肉瘤的全基因組甲基化分析中，發(fā)現(xiàn)多個(gè)參與組織發(fā)育、分化和腫瘤形成的基因（如 DNAJA4、HES5、IRX1、BMP8A、GATA4、GATA6、ALX3和P4HTM在RMS）均高甲基化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)胚胎型橫紋肌肉瘤和腺泡型橫紋肌肉瘤在基因啟動(dòng)子位點(diǎn)的甲基化譜存在差異，后者在多梳蛋白靶基因區(qū)域呈現(xiàn)明顯的高甲基化狀態(tài)。這些DNA甲基化特征可能有助于小兒橫紋肌肉瘤的診斷和風(fēng)險(xiǎn)分層，并有助于確定治療的新靶點(diǎn)。

2 組蛋白修飾

核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，除了DNA，每一個(gè)核小體還包含1個(gè)由H2A、H2B、H3、H4構(gòu)成的八聚體，相鄰2個(gè)核小體的八聚體之間由組蛋白H1相連接。組蛋白修飾也可影響基因表達(dá)，其末端的賴氨酸和精氨酸可以通過甲基化、乙酰化、泛素化、類泛素化或者磷酸化而化學(xué)修飾，直接使相關(guān)基因表達(dá)增加或減少，或通過改變啟動(dòng)子區(qū)域的親和性來(lái)影響基因表達(dá)［6］。

組蛋白修飾和全部的組蛋白密碼在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)方面較復(fù)雜，僅組蛋白甲基化就可以使特定氨基酸發(fā)生三甲基化、二甲基化、單甲基化或根本不被甲基化修飾。當(dāng)這些組蛋白甲基化過程發(fā)生異常時(shí)，就可以明顯改變基因組的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，致使正?；虻谋磉_(dá)破壞，從而誘發(fā)腫瘤。組蛋白甲基化修飾的異常可能與酶相關(guān)。組蛋白甲基化和去甲基化的過程均受到酶的調(diào)控，目前已知的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶有60多種，而賴氨酸的去甲基過程則僅有2個(gè)脫甲基酶（KDMs）家族調(diào)控，即黃素依賴性的KDM1家族和酮戊二酸依賴性（jumonji-type JmjC）的家族［7］。Walters等［8］在研究中發(fā)現(xiàn)，正常情況下JmjC組蛋白脫甲基酶JARID2處于低水平表達(dá)，細(xì)胞能順著肌源性譜系方向正常分化。在橫紋肌肉瘤中出現(xiàn)的融合蛋白PAX3-FPXO上調(diào)JARID2的表達(dá)水平，使肌細(xì)胞生成素（myoG）和MYL1啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27發(fā)生三甲基化，抑制正常的肌細(xì)胞分化而致瘤。除了酶的異常會(huì)導(dǎo)致組蛋白甲基化狀態(tài)的改變，發(fā)生甲基化的位點(diǎn)的改變也會(huì)使影響正常的化學(xué)修飾，從而改變基因的表達(dá)。組蛋白的甲基化可以發(fā)生在很多位點(diǎn)，不同位點(diǎn)的甲基化可以對(duì)基因表達(dá)的影響也不盡相同。有些位點(diǎn)的甲基化可以激活轉(zhuǎn)錄過程，如H3K4、H3K36和H3K79，而也有些位點(diǎn)甲基化可以抑制轉(zhuǎn)錄，如H3K9、H3K27、H3K56和H4K20［9］。

組蛋白的脫乙?；^程依賴于組蛋白脫乙酰基酶，Sirtuins（SIRT）蛋白是一種NAD+依賴性的組蛋白脫乙?；福壳叭藗円寻l(fā)現(xiàn)7種不同類型的SIRT。有研究表明，在約70%的肉瘤中可以觀察到SIRT 1的陽(yáng)性表達(dá)，并且提示臨床分期較高，組織學(xué)分級(jí)更高，更易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后事件。Kim等［10］在該研究中進(jìn)行了多變量分析，發(fā)現(xiàn)SIRT1表達(dá)的軟組織肉瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加10.062倍（95%CI，2.851～35.509，P＜0.001），無(wú)事件生存率風(fēng)險(xiǎn)增加2.459倍（95%CI，1.166～5.185，P=0.018），說明SIRT1可以作為肉瘤患者總體生存和無(wú)事件生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，因此其認(rèn)為SIRT1活化化合物（STAC）可能是肉瘤的新的治療靶點(diǎn)［10］。在Sonnemann等［11］設(shè)計(jì)的白藜蘆醇和合成STAC SRT1720對(duì)尤文氏肉瘤（ES）細(xì)胞對(duì)化療藥物依托泊苷和長(zhǎng)春新堿反應(yīng)性的影響研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，SRT1720能明顯增強(qiáng)依托泊苷和長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡作用，而天然存在的STAC白藜蘆醇則抑制此過程，所以在尤文氏肉瘤的治療中應(yīng)該避免含白藜蘆醇的膳食攝入［11］。同時(shí)研究中還發(fā)現(xiàn)涉及SIRT1的NOTCH誘導(dǎo)的腫瘤抑制新機(jī)制。該機(jī)制提示NOTCH通路可以直接抑制SIRT1，從而激活p53來(lái)發(fā)揮其抑瘤作用。在尤文氏肉瘤中，NOTCH信號(hào)被融合基因EWS-FLI1消除，而且SIRT1的陽(yáng)性表達(dá)可以抑制NOTCH信號(hào)誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)，也影響p53的正常功能［11］。也曾有研究發(fā)現(xiàn)未結(jié)合HIC1的SIRT1可以導(dǎo)致p53失活，從而誘發(fā)腫瘤［12］。因此SIRT1抑制劑對(duì)這些肉瘤的治療很有應(yīng)用前景。

多梳蛋白家族（PcG）中的一些成員在組蛋白修飾后可發(fā)揮致瘤或抑瘤的作用。PcG是一類染色質(zhì)水平上調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，其通過表觀遺傳修飾抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。Bmi1、JARID2、EZH2是多梳蛋白復(fù)合物（PRC）的重要組分，其中JARID2、EZH2基因的組蛋白在H3K27位點(diǎn)可發(fā)生甲基化修飾，起到抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的作用。目前研究最多的多梳蛋白復(fù)合物（PRC）為PRC1和PRC2，其可保持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，抑制胚胎干細(xì)胞的發(fā)育調(diào)節(jié)，也可以沉默腫瘤抑癌基因。YY1屬于PRC1的組成成分，YY1可以將組蛋白脫乙酰酶和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶引導(dǎo)至啟動(dòng)子，激活或抑制不同數(shù)量的啟動(dòng)子，從而參與組蛋白的調(diào)控。有研究［13］發(fā)現(xiàn)EZH2是保持細(xì)胞干性PCR2復(fù)合物的一部分，其表達(dá)異?？梢灾铝?。Marchesi等［14］研究證明EZH2直接結(jié)合RD細(xì)胞中的肌肉特異性基因，與YY1相同，在正常肌細(xì)胞分化過程中EZH2低水平表達(dá)，但在橫紋肌肉瘤呈高表達(dá)。橫紋肌肉瘤中EZH2的過表達(dá)可以抑制肌原性分化基因表達(dá)（如myoD1），從而阻斷肌細(xì)胞的正常分化，促進(jìn)惡性肉瘤的發(fā)生。Cleary等［15］研究發(fā)現(xiàn)，腺泡狀橫紋肌肉瘤的發(fā)生與NFκB-YYI-miR29調(diào)節(jié)電路失調(diào)相關(guān)，其認(rèn)為單獨(dú)的NFκB失活可能不足以減少生長(zhǎng)，但其當(dāng)與另一種靶向治療劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可能存在臨床獲益。上述研究表明，有必要進(jìn)一步探討潛在軟組織肉瘤治療靶點(diǎn)。

3 非編碼RNA的調(diào)控

MicroRNAs（miRNAs）和其他非編碼RNA雖然不能直接翻譯成蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，但是可以通過與mRNA結(jié)合使其降解，從而阻斷mRNA的翻譯過程。miRNAs對(duì)人類約三分之一的基因起調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)模式的異?？梢砸疖浗M織肉瘤的發(fā)生。一些MiRNAs參與肌肉的正常分化和增殖。有研究［16］發(fā)現(xiàn)miR133-1a、miR133-1b、miR-1和miR206均參與正常肌細(xì)胞的分化，其屬于具有肌肉特異性的miR?NA。PAX3的表達(dá)上調(diào)是橫紋肌肉瘤的特征之一，有研究［17］設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明miR-1和miR206可以靶向結(jié)合PAX3，并用證實(shí)了miR-206可以顯著下調(diào)橫紋肌肉瘤中的PAX3表達(dá)。miR-1、miR206、miR29可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因CCND2的表達(dá)。在橫紋肌肉瘤中CCND2轉(zhuǎn)錄物可以特異性被miR29抑制。所以miR-1、miR-206、miR-29可以通過穩(wěn)定PAX3和CCND2的表達(dá)參與肌肉分化和增殖過程，起到抑制腫瘤的作用。miRNA-203可以抑制NOTCH和JAK1/STAT1/STAT3通路，從而促進(jìn)正常的肌源性分化，有學(xué)者［18］認(rèn)為miRNA-203是橫紋肌肉瘤的腫瘤抑制劑。這些非編碼RNA與疾病之間的聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。

在尤文氏肉瘤中，miR-34的過度表達(dá)與長(zhǎng)期無(wú)病生存相關(guān)，這可能歸功于miR-34的抗增殖作用［19］。Fas信號(hào)通路涉及細(xì)胞凋亡和腫瘤增殖的調(diào)節(jié)，有實(shí)驗(yàn)表明miR-181c不受調(diào)節(jié)的表達(dá)可能通過影響Fas信號(hào)通路的表達(dá)促成尤文氏肉瘤，當(dāng)miR181c減少時(shí)，F(xiàn)AS受體表達(dá)增加，可以抑制的尤文氏肉瘤生長(zhǎng)。這為尤文氏肉瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)［20］。此外，Hameiri-Grossman等［21］認(rèn)為let-7b的低表達(dá)與尤文氏肉瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)，即let-7通過負(fù)調(diào)節(jié)RAS的表達(dá)來(lái)抑制尤文氏肉瘤的生長(zhǎng)。因此，RAS抑制劑具有很大的治療潛力。這些非編碼RNA及其作用機(jī)制均可為尤文氏肉瘤提供新的治療靶點(diǎn)以改善預(yù)后。

在不同的軟組織肉瘤中，表達(dá)失調(diào)的miRNA可能存在特異性，這些發(fā)現(xiàn)有益于軟組織肉瘤的鑒別診斷。通過等級(jí)聚類分析法發(fā)現(xiàn)，在700個(gè)miRNA中有35個(gè)在滑膜肉瘤里的表達(dá)具有差異性。Subra?manian等［22］在隊(duì)列分析中運(yùn)用全面的miRNA分析信息通過等級(jí)聚類法分離出平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤和正常的平滑肌細(xì)胞。Renner等［23］關(guān)于高級(jí)別肉瘤的研究中，滑膜肉瘤、惡性外周鞘瘤、黏液樣脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤也可以用等級(jí)聚類法區(qū)分開，但是其他的腫瘤并未在miRNA的隊(duì)列表達(dá)中表現(xiàn)出特異之處。有研究表明，在關(guān)于腺泡型和胚胎型橫紋肌肉瘤的235個(gè)miRNA隊(duì)列中有69個(gè)miRNA存在差異性表達(dá)，從而可用于不同亞型的鑒別［17］。在血液樣品中，根據(jù)miR-99 a-5p、miR-146b-5p［24］、miR-148b3p、miR-195-5p、miR-223-3p、miR-500b-3p和miR-505-3p的高表達(dá)可以區(qū)分滑膜肉瘤與健康對(duì)照的患者，也可以通過miRNAs的不同區(qū)分大多數(shù)其他種類的肉瘤，如平滑肌肉瘤，尤因肉瘤或脂肪肉瘤［24］。有研究［25］發(fā)現(xiàn)通過組織中miR-199b-5p、miR-320a、miR-199a-3p、miR-126、miR-22的不同表達(dá)水平，可以區(qū)分平滑肌肉瘤和未分化多形性肉瘤。同樣地，不同類型的脂肪肉瘤可以通過其不同類型的miRNA表達(dá)進(jìn)行區(qū)分。這些研究均對(duì)軟組織肉瘤的鑒別診斷提供了新思路。

在軟組織腫瘤細(xì)胞中，miRNA與組蛋白修飾的基因表達(dá)調(diào)節(jié)呈現(xiàn)協(xié)同作用，其表達(dá)失調(diào)可以促進(jìn)肉瘤的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a和miR29可以分別靶向影響EZH2和YY1，導(dǎo)致其在分化成肌細(xì)胞的細(xì)胞中降解［26］。在橫紋肌肉瘤中，這些miRNA的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致EZH2和YY1的過表達(dá)，致使（EZH2和YY1）附著于DNA，促進(jìn)肌細(xì)胞的原始分化并抑制miR29的表達(dá)［26］。在滑膜肉瘤中，SYT-SSX與EZH2的蛋白復(fù)合物將引起H3K27三甲基化和EGR1基因的表達(dá)下調(diào)。在尤文氏肉瘤中，EWS-FLI1融合蛋白可以直接誘導(dǎo)EZH2表達(dá)，也可以結(jié)合EZH2啟動(dòng)子，從而在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)出（腫瘤細(xì)胞）干細(xì)胞性而致瘤［26］。這些均可作為新的治療靶點(diǎn)。目前人們公認(rèn)EWS-FLI1在尤因氏肉瘤腫瘤發(fā)生中起主要作用，所以有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用EWS-FLI1抑制劑作為治療本病的手段［27-28］。此外有研究發(fā)現(xiàn)，米特拉霉素在小鼠模型中可以延緩腫瘤生長(zhǎng)［28］。組蛋白乙?；敢种苿┮?yàn)榫哂锌梢圆糠殖聊珽ZH2的作用，也可以嘗試用于肉瘤的治療［13］。

4 染色質(zhì)重塑

在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、重組等過程中，染色持重塑可導(dǎo)致核小體位置和結(jié)構(gòu)的變化，引起超染色質(zhì)變化。染色質(zhì)重塑包括多種變化，一般指染色質(zhì)特定區(qū)域?qū)嗣阜€(wěn)定性的變化。染色質(zhì)重塑的調(diào)節(jié)復(fù)合物目前已知有4組：SWI/SNF（BAF復(fù)合物）、ISWI、色素-酪氨酸酶 DNA 結(jié)合蛋白（CHD）和INO80。這些復(fù)合物可以打開或滑動(dòng)核小體，從而使DNA結(jié)合其他蛋白，或其可以將組蛋白替換為另一亞型［29］。有研究表明，BAF復(fù)合物可以改變滑膜肉瘤中的基因表達(dá)，其代替BAF47與SYT-SSX融合復(fù)合物結(jié)合，致使BAF47被降解并誘導(dǎo)Sox2基因表達(dá)，從而促進(jìn)滑膜肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［30］。有些染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)復(fù)合物也受到其他表觀遺傳學(xué)的調(diào)控，如mir193a-5p可以負(fù)調(diào)節(jié)SWI/SNF復(fù)合物中的SMARCB1；研究還發(fā)現(xiàn)在橫紋肌肉瘤與上皮樣肉瘤中，miR193a-5p低水平表達(dá)時(shí)可以出現(xiàn)SMARCB1 表達(dá)的變化［29，31］。如何通過影響染色質(zhì)重塑來(lái)抑制軟組織肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，有待更深一步的研究和探討。

5 結(jié)論與展望

DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNA的調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑均為細(xì)胞核功能的一部分，其正常的表達(dá)模式對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化有著重要意義。不同類型的表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制之間也存在相互影響，對(duì)軟組織肉瘤中表觀遺傳學(xué)機(jī)制的研究越深入，在分子機(jī)制中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)的機(jī)會(huì)越多，這將有益于軟組織肉瘤的臨床診斷與治療。