羊寄生蟲病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室速診技術(shù)

范斯敏（福建省南平市建陽區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 354200）

隨著畜牧業(yè)發(fā)展，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的診斷技術(shù)不斷更新，但以重大動物疫病的血清學(xué)和病原學(xué)檢測為主，對基層常見的普通動物疫病的診斷檢測較少。事實(shí)上，普通病種類繁多，嚴(yán)重影響動物健康養(yǎng)殖。近年來，羊的養(yǎng)殖量增長迅速，慢性消耗性的寄生蟲病隱性存在，難以確診，經(jīng)濟(jì)損失巨大，迫切需要得到及時有效的解決。本文針對羊寄生蟲病剖檢、糞檢、染色鏡檢等常規(guī)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室快速診斷手段進(jìn)行總結(jié)優(yōu)化，以探尋適用于基層的及時有效的動物臨床常見寄生蟲病獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室確診技術(shù)。

1 血液寄生蟲的檢查

1.1 制片

取病畜高溫時耳靜脈血液：（1）鮮血壓滴觀察：于載玻片上滴一滴生理鹽水，加一滴被檢血液后混合充分，蓋上蓋玻片稍靜置，于低倍鏡檢查發(fā)現(xiàn)有運(yùn)動蟲體后，換高倍鏡檢查（視野光線應(yīng)稍弱）。檢查蟲體運(yùn)動性。（2）血液涂片檢查：制作血涂片，用瑞氏或姬姆薩染色鏡檢。用于羊伊氏錐蟲、梨形蟲（泰勒蟲、巴貝斯蟲）檢查。

1.2 染色

1.2.1 瑞氏染色

由亞甲藍(lán)和伊紅配成的復(fù)合染色劑。（1）干燥后的血涂片上滴加數(shù)滴瑞氏染液，覆蓋染色約1min；（2）再滴加磷酸鹽緩沖液，吹勻，滯留5min；（3）緩慢搖動玻片，再從一側(cè)流水輕輕沖去染液，用濾紙吸干（或自然干燥），鏡檢。

1.2.2 姬姆薩染色

（1）常用姬姆薩染色液：約8滴原液配以5ml蒸餾水稀釋；（2）用甲醇固定抹片，干燥后浸入盛有染色液的染色缸中，或滴加足量染色液，染色30min，也可延長至1～24h，水洗，風(fēng)干，鏡檢。

1.3 蟲體濃集法

采抗凝血6ml，500r/min離心5min后，取上層血漿移入另一離心管（感染梨形蟲的紅細(xì)胞和錐蟲本身比正常紅細(xì)胞輕，上層血漿中含少量紅細(xì)胞，白細(xì)胞和蟲體），加適量生理鹽水2500r/min離心10min，取沉淀制片，染色，鏡檢?？捎糜诶嫘蜗x和伊氏錐蟲的檢查。也可結(jié)合溶血法檢查血液中的蠕蟲幼蟲（微絲蚴）：采血于離心管中，加入5%醋酸溶液以溶血，離心并吸取沉淀檢查。

2 呼吸道寄生蟲的檢查

一般在難以作鑒別診斷時，或是需要證實(shí)糞便中的蟲卵或幼蟲屬于呼吸道寄生蟲時進(jìn)行。用棉簽取鼻腔和氣管分泌物，可以通過誘咳以采集較多的檢查物，將采得的黏液涂于載片上鏡檢。羊肺絲蟲的蟲卵或幼蟲、肺吸蟲的蟲卵可出現(xiàn)在氣管分泌物中。

3 組織寄生蟲的檢查

3.1 組織觸片檢查

一些原蟲可在不同組織內(nèi)寄生。組織取樣一般在死后尸體剖檢時進(jìn)行（參見6），取一小塊組織樣，切面在載玻片上做成抹片、觸片，或?qū)⑿K組織固定后制成組織切片，染色檢查。抹片或觸片可用瑞氏染色或姬姆薩染色后觀察（染色方法見1.2）。

3.2 組織液抹片檢查

可取淋巴、腹水等組織液，制作抹片，進(jìn)行顯微鏡檢查病原體。

淋巴取樣方法：保定，一手向上方推移腫大的淋巴結(jié)，另一手固定淋巴結(jié)，進(jìn)行局部剪毛、消毒，用較粗的針頭刺入淋巴結(jié)抽取淋巴組織，將針頭內(nèi)容物涂成抹片固定，染色，鏡檢。適用于羊泰勒蟲、弓形蟲的檢查。羊感染泰勒蟲病后，可能出現(xiàn)局部體表淋巴結(jié)腫大，可取淋巴組織樣，鏡檢查出柯赫氏體（內(nèi)含許多小的裂殖子或染色質(zhì)顆粒）可確診。

腹水收集方法：側(cè)臥保定，在腹白線下側(cè)臍前方（母畜）或后方（公畜）1～2cm做穿刺，刺入腹腔后阻力驟減，有腹水流出。取得的腹水抹片，以瑞氏液或姬姆薩染色檢查。羊感染弓形蟲病，可取腹水做生前診斷，檢查滋養(yǎng)體；死后檢查可取組織或體液，檢查包囊和速殖子等。

3.3 其他組織檢查方法

肌肉中旋毛蟲檢查，可用傳統(tǒng)鏡檢法或消化法。（1）直接鏡檢法：取3mm×10mm的小塊膈肌肉樣0.5～1g，厚玻片壓緊，鏡檢。（2）消化法：取100g肉樣攪碎或剪碎放入3L燒杯中，加10g胃蛋白酶，溶于2L自來水；再加16ml25%鹽酸，放入磁力攪拌棒約45℃攪拌30min；消化液用180μm的濾篩過濾，轉(zhuǎn)入2L分離漏斗，靜置30min后放40ml液體于50ml量筒內(nèi)，靜置10min后吸去30ml上清液；再加30ml水搖勻，10min后再吸去30ml上清液。剩下液體倒入帶有格線的平皿內(nèi)，用20～50倍顯微鏡檢。

4 體表寄生蟲的檢查

4.1 皮膚刮取物檢查 [1]

用消毒外科凸刃小刀反復(fù)刮取患處與健康部交界處的表皮，至微出血。刮時將刀子沾上甘油或甘油溶液便于集樣。刮取物放于載玻片上，滴加50%甘油溶液，覆以另一張載玻片，搓壓使病料散開，鏡檢。

提高檢出率方法優(yōu)化：（1）濃集法：取較多病料置于試管中，加入10%NaOH溶液煮沸融化后靜置20min沉淀或以2000r/min離心5min，取沉渣鏡檢。（2）或?qū)⒐稳〉降母刹×戏庞谂囵B(yǎng)皿內(nèi)，加蓋；培養(yǎng)皿放于大約42℃溫水上12min，翻轉(zhuǎn)，可鏡檢皿底（黏附蟲體與少量皮屑）。（3）或?qū)⒐稳∥锓藕诩埳现?5℃溫箱一段時間，收集爬出的針尖大小的黃白色點(diǎn)狀物，鏡檢。適用于羊疥螨、癢螨的檢查。

4.2 毛囊結(jié)節(jié)檢查

檢查羊眼眶四周、頰部和鼻部、四肢的外側(cè)和腹部兩側(cè)、背部的皮膚，找到按摸有黃豆大或砂粒樣的結(jié)節(jié)，用小刀切開擠壓，挑取膿性分泌物或淡黃色干酪樣團(tuán)塊置于載片上，加1～2滴生理鹽水均勻涂成薄片，蓋片，低倍鏡鏡檢。適用于羊蠕形螨的檢查。

4.3 吸血節(jié)肢動物寄生蟲

肉眼觀察：虱、蜱、蚤、虱蠅等體型較大的寄生蟲。適用于羊狂蠅蛆?。z查鼻腔）、羊硬蜱病、虱病、虻病、蚤病的檢查。

5 寄生蟲的糞便檢查

5.1 蟲體和蟲卵的簡易檢查

（1）一些寄生蟲或其痕跡會隨糞便排出，可用玻璃棒攪拌，直接挑出判明蟲種。主要是寄生于動物消化道的寄生蟲，如：絳蟲的孕卵節(jié)片、線蟲等。

（2）直接涂片法：載玻片上滴2滴水或50%甘油水溶液，混合黃豆大小糞塊，剔除粗糞渣，加蓋玻片，鏡檢蟲卵。可用于羊各種蠕蟲（包括線蟲、絳蟲、吸蟲、棘頭蟲）的蟲卵和球蟲的卵囊檢查，但檢出率不高。

（3）蟲體染色法：檢查糞便中小而纖細(xì)的蟲體：可在糞便沉渣中滴加濃碘液，使糞便和蟲體均染成棕黃色，再加5%硫代硫酸鈉溶液脫色，因蟲體不脫色而其他物質(zhì)脫色而易于辨認(rèn)。

5.2 幼蟲分離法（貝爾曼氏法）

用一小段乳膠管鏈接漏斗和小試管，置漏斗架上，漏斗內(nèi)放置有被檢材料（糞便或組織）的糞篩或紗布，通過漏斗加40℃溫水至漏斗中部，靜置1～3h，拿下小試管，棄上清液，大部分幼蟲游走沉于試管底部，取管底沉淀物鏡檢。簡單平皿法分離幼蟲：取糞球若干個，置于表面玻璃或平皿內(nèi)，放不超過40℃的少量溫水，經(jīng)15min后取出糞球，吸取皿內(nèi)液體鏡檢幼蟲?？捎糜诨紫x的檢查和線蟲的鑒別。

5.3 蟲卵漂浮法

（1）飽和鹽水法[2]：400g食鹽溶于1000ml沸水，紗布過濾，冷卻備用。漂浮時，取弄碎的10g糞便于容器中，加適量飽和鹽水?dāng)噭蜻^濾后，靜置0.5h，蓋玻片直接蘸取液面后放于載玻片上，鏡檢；或用金屬圈（0.5～1cm直徑）取表面液膜，于載玻片上抖落，蓋片，鏡檢。檢查線蟲卵、絳蟲卵及球蟲卵囊。

（2）其他飽和溶液：檢查密度相對較大的蟲卵，如棘頭蟲蟲卵和吸蟲卵時，需要用硫酸鎂、硫代硫酸鈉及硫酸鋅等飽和溶液。羊隱孢子蟲卵囊用飽和蔗糖溶液漂浮法。

5.4 蟲卵沉淀法

5～10g搗碎后的糞便混合5～10倍清水?dāng)噭?，用銅篩（40～60孔）濾去大塊物質(zhì)，離心，棄上清液，加水?dāng)噭蛟俪恋恚磸?fù)2～3次至上層清亮。最后棄大部分上清后，留約為沉淀物1/2的溶液，用膠頭吸管吹吸均勻后取少量鏡檢。吸蟲卵、棘頭蟲卵密度比水大，可采用此方法檢查。

6 尸體剖檢

可檢查全身各個器官，或檢查某一器官、或某一種寄生蟲?？刹槊鲃游锼薪M織器官中的寄生蠕蟲，包括消化道、呼吸道及腦部寄生蟲的檢查，可彌補(bǔ)生前診斷法的不足，查出不排蟲卵的雄蟲和幼蟲等，并可做到計(jì)數(shù)和種類鑒別，是寄生蟲病確診的重要手段和依據(jù)。

7 總結(jié)

7.1 染色制片鏡檢要點(diǎn)

血液制成推片；組織制成觸片或抹片；滲出液、分泌物和培養(yǎng)物視黏稠度直接涂片，或者加適量生理鹽水稀釋。干燥與固定：讓涂片在空氣中自然干燥，或者樣品面朝上，通過火焰2～3次固定（以不燙手為宜）。血涂片必須干透后固定，否則細(xì)胞在染色過程中容易脫落。

各種染色應(yīng)注意：抹片滴上染色液后應(yīng)直接以流水沖洗，如果先倒掉染液容易發(fā)生染料沉渣黏附。如瑞氏染料顆粒沉積在血涂片上可滴加甲醇，然后立即用流水沖洗。沖洗時間不能過久，以防脫色。

瑞氏染色過淡可復(fù)染：復(fù)染時先加緩沖液，后加染液；染色過深可用流水沖洗或浸泡，也可用甲醇脫色。油鏡觀察姬姆薩染色片：鏡下背景為淡紅色，細(xì)菌為藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)染成淡紅色，細(xì)胞核為藍(lán)紫色；作焦蟲病檢查時，紅細(xì)胞染成淡紅色，紅細(xì)胞內(nèi)蟲體染為藍(lán)紫色。

7.2 其他

采用新鮮排出的或直接從羊直腸挖取的糞便做檢查。如糞便中蟲體較多，短期內(nèi)無法找完，可以將淘洗處理后的糞便沉渣加3%福爾馬林保存，以便有充足時間查找更多蟲體。此外，還有幼蟲培養(yǎng)法、毛蚴孵化法，用時較長，此不贅述。

[1]汪明.獸醫(yī)寄生蟲學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003:30-38.

[2]江斌,吳勝會,張世忠.羊病速診快治[M].福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社,2016:14-15.