RNA干擾沉默DcR3對人胰腺癌細胞化療藥物敏感性影響的實驗研究

肖華平，謝 輝，羅春陽，李 慶，方玉江

1.湘南學院附屬醫(yī)院腫瘤防治中心，湖南 郴州 423000；

2. 美國密蘇里大學醫(yī)學院Ellis Fischel腫瘤中心，密蘇里州 哥倫比亞 65212

胰腺癌是一種臨床表現(xiàn)隱匿、發(fā)展迅速、預后極差的消化道惡性腫瘤，由于胰腺癌早期癥狀隱匿，診斷困難，因而存活率極低［1］?；熓瞧渲匾闹委煼椒?，然而至今單純的化療并沒有給患者帶來明顯的生存獲益。更為遺憾的是，至今還未找到在胰腺癌對化療藥物耐受機制中起重要作用的耐受基因。一般認為，化療無效是由于凋亡受體或凋亡相關蛋白發(fā)生改變，使凋亡信號不能順利繼續(xù)傳遞所致［2-3］。因此，我們在胰腺癌細胞中尋找能夠影響其凋亡通道信號順利傳遞的基因，通過基因敲除減少該基因?qū)Φ蛲鐾ǖ赖挠绊?，以期達到提高胰腺癌治療效果的目的。

Fas是廣泛存在于正常細胞和腫瘤表面的Ⅰ型跨膜蛋白，F(xiàn)as配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)是Fas的天然配體，屬于Ⅱ型膜蛋白。在部分惡性腫瘤細胞中FasL與Fas的結(jié)合產(chǎn)生的死亡信號是誘導腫瘤細胞凋亡的重要途徑之一，誘騙受體-3(decoy receptor 3，DcR3)是Pitti等［4］在1998年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子受體超家族成員，是一種分泌型的可溶性的蛋白分子，在它的氨基酸序列中缺少明顯的跨膜結(jié)構，其配體包括FasL、LIGHT和LTβR。有研究發(fā)現(xiàn)，DcR3通過競爭性抑制Fas和FasL的結(jié)合，以及阻斷LIGHT和LTβR及HVEM/TR2的相互作用，從而阻斷FasL和LIGHT介導產(chǎn)生的細胞凋亡，被認為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸密切相關［5-7］。本研究采用RNA干擾技術沉默DcR3，旨在觀察DcR3-siRNA對人胰腺癌AsPC-1細胞凋亡和化療敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細胞株

HiPerFect Transfection Reagent試劑盒購自德國QIAGEN公司，ELISA檢測試劑盒購自美國Bio-Techne公司，DcR3、β-actin、Caspase-8和Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，F(xiàn)asL抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，核蛋白提取試劑盒購自美國Pierce公司，TRIzol購自美國Gibco公司，堿性磷酸酶共軛抗兔及抗鼠IgG二抗購自美國Sigma公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Annexin-Ⅴ/PI凋亡檢測試劑盒和流式細胞儀購自美國BD公司，注射用吉西他濱購自美國Eli Lilly公司(批準文號：H20110535)；人胰腺癌細胞株AsPC-1由美國密蘇里大學醫(yī)學院Ellis Fischel腫瘤中心方玉江教授惠贈。

1.2 DcR3-siRNA的構建

應用篩選siRNA的軟件，選取DcR3靶序列為5’-CGCUGCAGCCUCUUGAU GGAGAUGUCC-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成DcR3特異性siRNA序列。正義鏈序列：5’-ACACCCACCUACCC CUGGCTT-3’；反義鏈序列：5’-GCCAGGGGU AGGUGGGUGUTT-3’。同時將上述寡核苷酸序列打亂重新組合，設計5’-GACACACCACCU CCCCUGCTT-3’和5’-GGCGACGGGUGUGA GGUGUTT-3’作為陰性對照。

1.3 細胞培養(yǎng)

人胰腺癌細胞株AsPC-1培養(yǎng)條件為：含10%小牛血清PRMI-1640培養(yǎng)基(內(nèi)含100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 基因轉(zhuǎn)染

按照HiPerFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書中的實驗步驟進行。用胰酶消化細胞后，接種于6孔板上，轉(zhuǎn)染時細胞每孔達到30%～50%。用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基將已經(jīng)構建的DcR3-siRNA稀釋至100 nmol/L，混合均勻后加入HiPerFect，混合均勻后加入培養(yǎng)孔中。置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后可進行表達檢測。同時設未轉(zhuǎn)染對照組(control組)和轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒對照組(mock組)。

1.5 ELISA實驗

應用核蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，進行ELISA實驗。首先用濃度100 μL/孔的抗DcR3單克隆抗體包被ELISA板，置于37 ℃下4 h；再加入5%小牛血清置于37 ℃下封閉40 min，封閉時將封閉液加滿各反應孔，封閉結(jié)束后用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min；將稀釋好的DcR3純標品和待測樣品加入酶標反應孔中，每樣品至少加雙孔，每孔100 μL，置于37 ℃下40～60 min，用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min；最后將生物素標記的抗DcR3抗體加入板中，室溫溫育1 h，每孔加入底物TMB 100 μL置于37 ℃條件下避光放置10 min，加入終止液顯色，用酶標儀于492 nm處測定吸光度(D)值。

1.6 MTT實驗

取對數(shù)生長期未轉(zhuǎn)染的AsPC-1細胞、轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的AsPC-1細胞及轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA的AsPC-1細胞，分別接種于96孔培養(yǎng)板上，每5孔為1復孔，每孔接種1×104個細胞，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后分別加入不同濃度的吉西他濱(0、0.01、0.1、1、10和100 μg/mL)，設空白對照，加入等量培養(yǎng)基；72 h后加入5 mg/mL的MTT試劑10 μL；4 h后移去上清液，加入DMSO溶解沉淀，30 min后用酶標儀于490 nm處測定D值，細胞存活率=(實驗組D值/對照組D值)×100%，以橫座標為藥物濃度，縱坐標為細胞存活率，繪制細胞存活曲線；計算IC50，IC50=lg-1［Xm-i(ΣP-0.5)］，其中，Xm為設計的最大濃度的對數(shù)值，i為各濃度倍比濃度的對數(shù)值，ΣP為各組生長抑制率之和，0.5為經(jīng)驗常數(shù)［8］，重復4次，取平均值。

1.7 流式細胞術Annexin-Ⅴ/PI雙染色實驗

取用濃度為10 μg/mL的吉西他濱處理48 h后的細胞用胰酶消化成懸液，收集細胞(5×105個)，PBS清洗2次，1×結(jié)合緩沖液再洗1次，按照Annexin-Ⅴ/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行實驗操作，即每份細胞加入100 μL的Binding Buffer、3 μL Annexin-Ⅴ和3 μL PI，混勻，室溫、避光、反應15 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.8 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)

收集各組細胞，加入細胞裂解液(裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑等體積混合，再加入DTT溶液，濃度為1 mmol/L)裂解細胞，提取總蛋白。用Bradford法測定蛋白濃度后各組取200 μg蛋白樣本進行SDS-PAGE，通過電轉(zhuǎn)印法將蛋白從SDS上轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，加入一抗(DcR3和FasL為1∶1 000；Caspase-8和Caspase-3為1∶500；β-actin為1∶2 000)，于4 ℃下溫育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶連接的二抗(1∶2 000)室溫振蕩溫育1 h，最后NBT/BCIP顯影，以目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值計算目的蛋白的相對表達量。

1.9 RTFQ-PCR

用TRIzol提取各組細胞的總RNA，各取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μL cDNA以F a s L引物(上游5’-G G T T G C C T T G G TAGGATTGG-3’，下游5’-CCTTGAGTTG GACTTGCCTGTT-3’，產(chǎn)物長度為196 bp)、Caspase-8引物(上游5’-TACTAC C G A A A C T T G G A C C-3’， 下 游5’-GTGAAAGTAGGTTGTGGC-3’，產(chǎn)物長度為515 bp)、Caspase-3引物(上游5’-ATGGAGAACAATAAAACCT-3’，下游5’-CTAGTGATAAAAGTAGAGTTC-3’，產(chǎn)物長度為834 bp)及GAPDH引物(上游5’-TGACTTCAACAGCGACACCCAC-3’，下游5’-AACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3’，產(chǎn)物長度為277 bp)進行PCR擴增，分別檢測各組中的FasL、Caspase-8、Caspase-3和內(nèi)參GAPDH的mRNA表達水平。PCR反應條件為：94.0 ℃變性45 s；60.0 ℃(FasL)、50.6 ℃(Caspase-8)、50.0 ℃(Caspase-3)退火60 s，進行30個循環(huán)，72.0 ℃延伸5 min。最后取擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，產(chǎn)物條帶用凝膠成像系統(tǒng)照相并進行灰度分析，目的片段的相對表達量=目的基因的灰度值/GAPDH的灰度值。

1.10 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，細胞存活率、抑制率及凋亡率用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后AsPC-1細胞中DcR3蛋白水平的變化

采用ELISA檢測DcR3蛋白量，結(jié)果顯示，DcR3-siRNA組的DcR3蛋白量明顯少于control組和mock組(P＜0.01，圖1A)。Western blot結(jié)果進一步證實，DcR3-siRNA組中DcR3蛋白的表達水平明顯低于control組和mock組(P＜0.01，圖1B)。DcR3-siRNA對DcR3蛋白表達具有特異性的基因沉默效應，其沉默的效率與ELISA結(jié)果一致。

圖 1 各組細胞中DcR3蛋白的表達Fig. 1 The expression of DcR3 protein in Aspc-1 cells

2.2 轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后AsPC-1細胞對吉西他濱化療敏感性的變化

應用MTT實驗檢測AsPC-1細胞對吉西他濱的敏感性。結(jié)果顯示，control組、mock組和DcR3-siRNA組AsPC-1細胞的存活率隨著吉西他濱濃度增加而降低，DcR3-siRNA組AsPC-1細胞的存活率降低更顯著(圖2A)；DcR3-siRNA組AsPC-1細胞對吉西他濱的IC50值為(0.21±0.02) μg/mL，mock組AsPC-1細胞對吉西他濱的IC50值為(2.25±0.32) μg/mL，control組AsPC-1細胞對吉西他濱的IC50值為(2.16±0.35) μg/mL。轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后，AsPC-1細胞對吉西他濱的敏感性明顯增加，與mock組和control組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2B)。

2.3 吉西他濱處理后各組AsPC-1細胞凋亡的變化

流式結(jié)果顯示，10 μg/mL吉西他濱處理48 h后control組、siRNA(-)組和DcR3-siRNA組細胞凋亡率分別為11.2%±0.34%、11.5%±1.15%和54.1%±2.76%，DcR3-siRNA組凋亡率明顯高于control組和mock組(P＜0.05，圖3)，提示吉西他濱處理后的DcR3-siRNA組細胞凋亡現(xiàn)象更加嚴重。

2.4 轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后各組細胞中FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白和mRNA表達的變化

Control組、mock組和DcR3-siRNA組細胞接受吉西他濱處理后，采用Western blot檢測各組FasL、Caspase-8和Caspase-3的蛋白表達，結(jié)果顯示，DcR3-siRNA組FasL、Caspase-8和Caspase-3的蛋白表達水平明顯高于其他各組，三者之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖4A、B、C)。RTFQ-PCR進一步證實，轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后可以上調(diào)FasL、Caspase-8和Caspase-3 mRNA的表達(圖4D、E、F)，其上調(diào)的效應與Western blot結(jié)果一致。

圖 2 不同濃度吉西他濱處理后各組細胞存活曲線和IC50Fig. 2 The cell viability and IC50 of different concentrations of gemcitabine after treatment

圖 3 吉西他濱處理后各組AsPC1細胞的凋亡情況Fig. 3 Apoptosis of AsPC1 cells in each group treated with gemcitabine

3 討 論

多項研究發(fā)現(xiàn)，DcR3在胰腺癌中高表達，與胰腺癌化療敏感性密切相關［8-10］。Sung等［9］研究肺癌細胞發(fā)現(xiàn)，DcR3的高表達增強了腫瘤細胞對放射的抵抗，當敲除DcR3基因后，可以明顯增加腫瘤細胞凋亡，從而增加肺癌細胞的化療敏感性。Wang等［10］研究提示，沉默胰腺癌中DcR3高表達，可以增加胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性。

本實驗將DcR3-siRNA轉(zhuǎn)染至AsPC-1細胞后，通過藥物敏感性實驗發(fā)現(xiàn)，沉默DcR3基因組的AsPC-1細胞對放射的敏感性明顯要高于未沉默的細胞組?；熕幬锾幚砗?，沉默DcR3基因的AsPC-1細胞組凋亡率明顯高于未沉默組的細胞凋亡率。提示沉默DcR3基因后可以促進化療誘導的凋亡而增加人胰腺癌AsPC-1細胞的化療敏感性。

DcR3調(diào)節(jié)細胞的凋亡是通過與FasL競爭性的結(jié)合而阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導來實現(xiàn)的。FasL凋亡信號轉(zhuǎn)導與Caspase的激活密切相關，本實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后AsPC-1細胞中的FasL、Caspase-8和Caspase-3都存在明顯的上調(diào)現(xiàn)象。Caspase-8基因是FasL途徑凋亡通路的啟動基因，其下游就是Caspase-3基因，Caspase-3基因被認為是FasL凋亡途徑的最終執(zhí)行者［11］。本實驗結(jié)果提示，DcR3-siRNA誘導細胞凋亡增加細胞放射敏感性可能是通過激活FasL/Caspase途徑來實現(xiàn)的。

圖 4 轉(zhuǎn)染DcR3-siRNA后可激活FasL、Caspase-8和Caspase-3的表達Fig. 4 The expression of FasL, Caspase-8 and Caspase-3 after transfect DcR3-siRNA

本研究表明，RNA干擾沉默DcR3基因可以增加人胰腺癌AsPC-1細胞對吉西他濱的敏感性，可能是沉默DcR3基因可激活FasL/Caspase凋亡途徑，促進細胞凋亡所致。提示DcR3→FasL→Caspase通路在人胰腺癌細胞對化療的敏感性起著至關重要的作用，有望成為人胰腺癌細胞基因治療新的靶點之一。

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