真菌毒素（DON、AFB1）對(duì) HepG2/C3A細(xì)胞聯(lián)合毒性及機(jī)理研究

李文竹， 張根義， 桑亞秋

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （Deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱DON）是一種單端孢霉烯族毒素，主要是由生長(zhǎng)在谷類物品如小麥、玉米等上的粉紅鐮刀菌和禾谷鐮刀菌產(chǎn)生。因該毒素能夠引發(fā)動(dòng)物嘔吐的特征，故將其定名為嘔吐毒素 （Vomitoxin）[1-2]。黃曲霉毒素（Aflatoxin，簡(jiǎn)稱AFT）是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉在一定條件下產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物的總稱[3-4]。在大豆、玉米、牛奶等制品中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)其存在，黃曲霉毒素已經(jīng)導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題。其中黃曲霉毒素B1的毒性最強(qiáng)，具有很強(qiáng)的致癌性、致畸性和致突變性[5-7]。AFB1是一種肝毒素，主要作用于肝臟細(xì)胞，而DON雖無(wú)明確的靶器官，但是主要作用于分裂較快的細(xì)胞[8]。實(shí)驗(yàn)采用HepG2/C3A作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，除能形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，有利于實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性，一致性外，還具有較高的P450酶系，主要參與外源性藥物的代謝，對(duì)體內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化也起到重要作用[9-10]。近幾年，國(guó)內(nèi)外研究者也對(duì)其聯(lián)合作用有不同的研究，國(guó)外對(duì)于坦桑尼亞北部人群食用比目魚(yú)可能接觸到多種真菌毒素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AFB1與DON同時(shí)存在，并且對(duì)于當(dāng)?shù)匦『⒃斐蓢?yán)重毒害現(xiàn)象[11]。有研究表明，當(dāng)AFB1與DON同時(shí)作用于豬的肝臟細(xì)胞后，其細(xì)胞存活率明顯下降，可以觀察到線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張以及許多脂肪粒等現(xiàn)象，其聯(lián)合作用效果表現(xiàn)出明顯的加和效應(yīng)[12]，但是并沒(méi)有涉及到基因表達(dá)層面的具體毒性機(jī)制?，F(xiàn)如今人們面臨真菌毒素的危害多是2種或者2種以上真菌毒素的同時(shí)存在，這也大大增加了對(duì)人及動(dòng)物的危害性。而當(dāng)前國(guó)內(nèi)外主要側(cè)重于研究單一真菌毒素毒性情況，對(duì)于2種或多種真菌毒素的聯(lián)合作用研究尚且不多[13-14]。DON與AFB1常存在于同一谷物中，因此本研究主要探討2毒素對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞的聯(lián)合毒性作用，及誘導(dǎo)HepG2/C3A細(xì)胞發(fā)生凋亡的毒性機(jī)制探究，為研究多種真菌毒素共存時(shí)的聯(lián)合作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，并結(jié)合低濃度下引起細(xì)胞凋亡程度對(duì)真菌毒素的早期檢測(cè)提供依據(jù)，在食品安全方面具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肝癌細(xì)胞株HepG2/C3A，美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)提供；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、二甲亞楓（DMSO）、SRB 染料、 三氯乙酸 （TCA）、Tris base、Hoechst33258、小牛胸腺DNA，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；黃曲霉毒素B1（AFB1），上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品；DMEM低糖培養(yǎng)基、MEM、HEPES、胎牛血清（FBS）、含 2.5 g/L EDTA 的胰蛋白酶（Trypsin）、無(wú)酚紅 HBSS，Gibco 公司產(chǎn)品；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，碧云天公司產(chǎn)品；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒，常州博弘生物工程有限公司產(chǎn)品。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；熒光酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國(guó)碧迪公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 從液氮灌中取出凍存管于37℃恒溫水浴鍋中解凍1 min左右，并輕輕搖動(dòng)令其盡快融化，用乙醇消毒后開(kāi)啟，吸出細(xì)胞懸液于離心管中，900 r/min離心5 min，棄上清液，加入含有體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清培養(yǎng)液，并輕輕吹打，接種到培養(yǎng)瓶中，于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，次日用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清培養(yǎng)液更換進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。HepG2/C3A細(xì)胞采用含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%MEM以及體積分?jǐn)?shù)1%的HEPES的DMEM低糖培養(yǎng)基于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)到正常狀態(tài)并處于對(duì)數(shù)期即可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 DON、AFB1對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞單獨(dú)及聯(lián)合抑制率的測(cè)定 采用SRB染色法[15]測(cè)定細(xì)胞增值抑制率。調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，接種于96孔板，同時(shí)設(shè)定空白組，孵育24 h后，加入含毒素的培養(yǎng)液。設(shè)置DON、AFB1單獨(dú)作用濃度分別為：DON濃度為 0 （溶劑對(duì)照組）、0.56、1.125、2.25、4.5、6.75 μmol/L；AFB1濃度為 0（溶劑對(duì)照組）、2.5、5、10、20、30 μmol/L。 聯(lián)合染毒濃度為 0（溶劑對(duì)照組），DON（0.56 μmol/L） +AFB1（2.5、5、10、20 μmol/L）；DON（1.125 μmol/L）+AFB1（2.5、5、10、20 μmol/L）；DON（2.25 μmol/L）+AFB1（2.5、5、10、20 μmol/L）。 每組設(shè)定5個(gè)平行孔，繼續(xù)孵育24 h后，加入200 μL 4℃遇冷的三氯乙酸（TCA）溶液，4℃下固定1 h后，用去離子水洗4遍，室溫晾干，加入4 g/L SRB染液，室溫下避光染色30 min，體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸溶液洗4遍，室溫晾干。加入10 mmol/L的Tris base緩沖溶液200 μL，于酶標(biāo)儀上震蕩5 min后測(cè)定490 nm下的吸光度 （A）。計(jì)算不同濃度的真菌毒素對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞的增值抑制率。增值抑制率計(jì)算式：

增值抑制率=[1-（A1-A0）/（A1-A0）]×100%[16]。式中，A1表示實(shí)驗(yàn)組吸光度值，A0表示空白組吸光度值

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)總雙鏈DNA含量測(cè)定 調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/孔，接種于96孔板，孵育 24 h后，加入含毒素的培養(yǎng)液。DON、AFB1單獨(dú)及混合作用濃度同1.2.2。每組設(shè)定5個(gè)平行孔，繼續(xù)孵育24 h后，用37℃預(yù)熱的HBSS洗一遍，將96孔板置于-80℃冰箱中冷凍1 h后于37℃水浴鍋中加熱30 min，加入 100 μL 去離子水，再次冷凍 1 h，將其取出后于37℃水浴鍋中加熱30 min，向每個(gè)孔中加入 100 μL 20 μg/mL 的 Hoechst 33258 染液，搖晃孔板使其混勻。同時(shí)配制小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。室溫下避光靜置30 min，采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的熒光值。

1.2.4 HepG2/C3A細(xì)胞凋亡率測(cè)定 調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔，接種于 12孔板，孵育 24 h后，分別對(duì)應(yīng)加入 0.56 μmol/L DON 和 2.5 μmol/L AFB1以及兩者混合濃度，并設(shè)定對(duì)照組繼續(xù)孵育24 h后，PBS洗滌貼壁細(xì)胞并收集細(xì)胞，取5萬(wàn)～10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1 200 r/min離心 5 min，加入 195 μL AnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。再加入5 μL AnnexinV-FITC，輕輕混勻后，加入 10 μL 碘化丙啶染色液，室溫避光孵育15 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 HepG2/C3A細(xì)胞周期測(cè)定 調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔，接種于 12孔板，孵育24 h后，分別對(duì)應(yīng)加入 0.56 μmol/L DON 和 2.5 μmol/L AFB1以及兩者混合濃度，并設(shè)定對(duì)照組繼續(xù)孵育24 h后，PBS洗滌貼壁細(xì)胞并收集細(xì)胞，加入1 mL冰浴預(yù)冷的PBS，重懸，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 mL冰浴預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，混勻，4℃固定24 h。再次1 200 r/min離心5 min，加入1 mL冰浴預(yù)冷的PBS繼續(xù)1 200 r/min離心5 min，最后棄上清液，加入PI染色工作液500 μL，37℃孵育30 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/孔，接種于6孔板，孵育24 h后，分別對(duì)應(yīng)加入 0.56 μmol/L DON 和 2.5 μmol/L AFB1以及兩者混合濃度，并設(shè)定對(duì)照組繼續(xù)孵育24 h后。采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒進(jìn)行RNA提取，采用PrimeScriptTMRT試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，以及采用SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行QPCR反應(yīng)。按2-△△Ct方法計(jì)算。上下游引物以及內(nèi)參引物序列見(jiàn)下表1所示。

表1 凋亡相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer pairs for apoptosis-related gene in RTq-PCR analysis of gene expression

1.2.7 RNA-Seq測(cè)序 調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/孔，接種于6孔板，孵育24 h后，分別對(duì)應(yīng)加入0.56 μmol/L DON和2.5 μmol/L AFB1以及兩者混合濃度，并設(shè)定對(duì)照組繼續(xù)孵育24 h后，收集細(xì)胞并速凍后利用干冰運(yùn)送，委托深圳華大基因進(jìn)行RNASeq全基因測(cè)序。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有試驗(yàn)重復(fù)3次，每組濃度設(shè)定5個(gè)平行。采用origin85進(jìn)行繪圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析 （One-way ANOVA），以p＜0.05為顯著性差異，p＜0.01代表具有高度顯著差異。聯(lián)合作用類型采用成對(duì)樣本T檢驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）形式表示。

2 結(jié)語(yǔ)與討論

2.1 DON、AFB1對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞增殖抑制率影響

真菌毒素 DON、AFB1單獨(dú)及聯(lián)合作用于HepG2/C3A細(xì)胞后，其結(jié)果表明，不同濃度DON、AFB1以及兩者混合毒素分別處理HepG2/C3A細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，隨著毒素處理劑量的增加，單獨(dú)作用時(shí)的毒素對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞的增值抑制率不斷增加，呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。如圖1（a）所示，當(dāng)DON單獨(dú)作用24 h，濃度從0.56～6.75 μmol/L時(shí)，其抑制率從25.24%增加到50.62%，而AFB1單獨(dú)作用濃度從2.5～30 μmol/L時(shí)，其細(xì)胞增值抑制率由20.18%增加到39.22%。當(dāng)兩者以不同濃度混合作用于該細(xì)胞時(shí)如圖1（b）所示，其細(xì)胞抑制率不斷增加，并且均高于單獨(dú)作用時(shí)的抑制率，呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。由圖1（a）可以看出DON的毒性較AFB1要高，當(dāng)毒素濃度逐漸升高，對(duì)細(xì)胞的損傷作用越大，造成細(xì)胞死亡越嚴(yán)重。

圖1 真菌毒素DON、AFB1對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞的增值抑制率的影響（24 h）Fig.1 Effect of DON and AFB1on proliferation inhibition rate on HepG2/C3A cells（24 h）

2.2 DON、AFB1對(duì)細(xì)胞內(nèi)總雙鏈DNA相對(duì)含量的影響

當(dāng)細(xì)胞受到真菌毒素的作用時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷，造成細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈發(fā)生一系列變化，從而引起DNA損傷。不同濃度DON、AFB1以及兩者混合毒素分別處理HepG2/C3A細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，隨著毒素處理劑量的增加，單獨(dú)作用時(shí)的毒素使得HepG2/C3A細(xì)胞內(nèi)的雙鏈DNA含量不斷減少，呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。如圖2(a)所示，當(dāng)DON濃度從0.56～6.75 μmol/L時(shí)，其相對(duì)含量從75.28%下降到50.90%，而AFB1單獨(dú)作用濃度從2.5～30 μmol/L時(shí)，其雙鏈DNA相對(duì)含量由79.56%下降到58.87%?？梢钥闯鯠ON引起DNA相對(duì)含量變化程度高于AFB1。當(dāng)兩者以不同濃度混合作用于該細(xì)胞時(shí)，結(jié)合圖2(b)所示，可以看出其細(xì)胞內(nèi)DNA相對(duì)含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，并且均低于單獨(dú)作用時(shí)的DNA相對(duì)含量。

2.3 DON、AFB1對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

正常細(xì)胞中磷酯酰絲氨酸（PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，細(xì)胞受到外來(lái)刺激，引起細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時(shí)，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)遷移到細(xì)胞膜外表面。Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。AnnexinV選擇性的結(jié)合PS從而可以檢測(cè)到細(xì)胞的早期凋亡。而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它并不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但是在細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡的時(shí)候，細(xì)胞膜通透性增加，此時(shí)PI可以透過(guò)細(xì)胞膜使得細(xì)胞核染成紅色。采用AnnexinV-FITC雙染試劑[17]，可以判斷出細(xì)胞出現(xiàn)各個(gè)凋亡階段的情況。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，低濃度的0.56 μmol/L DON、2.5 μmol/L AFB1以及兩者混合毒素分別處理HepG2/C3A細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，兩者均能引起細(xì)胞產(chǎn)生顯著的凋亡現(xiàn)象，并且聯(lián)合作用條件下引起細(xì)胞發(fā)生凋亡的程度均高于單獨(dú)作用時(shí)的情況。

圖2 真菌毒素DON、AFB1對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞內(nèi)雙鏈DNA的影響（24 h）Fig.2 Effect of DON and AFB1on DNA content on HepG2/C3A cells（24 h）

圖3 真菌毒素DON、AFB1對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞凋亡率的影響（24 h）Fig.3 Effect of DON and AFB1on apoptosis rate of HepG2/C3A cells（24 h）

2.4 DON、AFB1對(duì)細(xì)胞周期的影響

碘化丙啶（PI）是一種雙鏈DNA熒光染料，與雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與雙鏈DNA相對(duì)含量成正比。因此，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞中DNA相對(duì)含量，使用Modifit軟件分析細(xì)胞周期分布，得出各個(gè)時(shí)期細(xì)胞所占比例，從而判斷出各毒素組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)階段的阻滯情況[18]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，0.56 μmol/L DON、2.5 μmol/L AFB1以及兩者混合毒素分別處理HepG2/C3A細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，0.56 μmol/L DON組能夠引起G2/M期細(xì)胞增加，而2.5 μmol/L AFB1組能夠引起S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，當(dāng)兩者混合作用于HepG2/C3A細(xì)胞時(shí)，能同時(shí)引起S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，說(shuō)明0.56 μmol/L DON可以引起細(xì)胞G2/M期發(fā)生阻滯，2.5 μmol/L AFB1以及兩者混合作用下可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生S期和G2/M期阻滯現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)分析，2種真菌毒素單獨(dú)作用引起HepG2/C3A細(xì)胞周期發(fā)生變化與聯(lián)合作用時(shí)并不具有顯著差異（p＜0.05），這也再次說(shuō)明了2種真菌毒素作用于HepG2/C3A細(xì)胞的聯(lián)合作用類型為加和作用。

圖4 真菌毒素DON、AFB1對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞周期的影響（24 h）Fig.4 Effect of DON and AFB1on cell cycle of HepG2/C3A cells（24 h）

2.5 DON、AFB1對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量影響

為了進(jìn)一步研究DON和AFB1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，又通過(guò)RT-qPCR對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3，Bax和 Bcl-2 mRNA水平進(jìn)行研究，見(jiàn)圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，caspase-3和Bax的mRNA相對(duì)表達(dá)量增加而B(niǎo)cl-2表達(dá)量則下降且變化具有顯著性差異。并且2種毒素的混合作用引起的相關(guān)基因mRNA表達(dá)程度均要高于單獨(dú)作用情況，后者Bcl-2混合作用時(shí)的表達(dá)量低于單獨(dú)作用時(shí)的表達(dá)水平。這進(jìn)一步證明二者作用于HepG2/C3A細(xì)胞的聯(lián)合效應(yīng)為加和效應(yīng)。

圖5 真菌毒素DON、AFB1對(duì)HepG2/C3A細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響（24 h）Fig.5 Effect of DON and AFB1on apoptosis-relative genes mRNA level of HepG2/C3A cells（24 h）

2.6 DON、AFB1對(duì)細(xì)胞聯(lián)合毒性作

實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)以上細(xì)胞毒性指標(biāo)的測(cè)定來(lái)分析其可能的相互作用類型，通過(guò)對(duì)上述毒性指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)值與理論值進(jìn)行成對(duì)樣本T檢驗(yàn)分析其顯著性來(lái)說(shuō)明此2種真菌毒素作用于HepG2/C3A細(xì)胞的聯(lián)合毒性類型。其分析結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2 成對(duì)樣本T檢驗(yàn)分析HepG2/C3A細(xì)胞內(nèi)四個(gè)毒性指標(biāo)實(shí)驗(yàn)值與理論值的差異Table 2 Differences between EV and TV on HepG2/C3A cells by paired-samples T-tests

經(jīng)過(guò)成對(duì)樣本T檢驗(yàn)分析后得出，上述2個(gè)毒性指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)值與理論值之間并沒(méi)有顯著差異，即p＞0.05。表明這2種毒素作用于HepG2/C3A細(xì)胞的聯(lián)合類型為加和作用。

2.7 RNA-Seq測(cè)序及機(jī)理研究

2.7.1 差異基因表達(dá)篩選及聚類分析 經(jīng)RNASeq測(cè)序，我們進(jìn)行3組樣品的對(duì)比分析，利用RPKM（Reads Per Kb Million reads）算法[19]計(jì)算出每組比對(duì)樣品中基因的表達(dá)量，通過(guò)比較不同樣本之間的數(shù)據(jù)從而篩選出差異表達(dá)的基因，其組間差異基因見(jiàn)圖6（a）所示。其中AFB1處理組中有182個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，6個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；DON處理組中有74個(gè)表達(dá)基因上調(diào)，79個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；混合處理組中基因表達(dá)上調(diào)的有260，基因表達(dá)下調(diào)的有98個(gè)。針對(duì)組間差異之間的交集聚類分析，取顯著差異表達(dá)基因差異倍數(shù)的log2值利用cluster軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖6（b）所示，其中每一行代表一個(gè)基因，每一列代表一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，右邊對(duì)應(yīng)的是該基因的ID號(hào)。

圖6 3組比對(duì)樣本間差異基因統(tǒng)計(jì)和聚類分析Fig.6 Three groups of differentially expressed genes and cluster analysis

2.7.2 Pathway分析 通過(guò)對(duì)富集出來(lái)的差異基因，進(jìn)一步做pathway富集分析，主要是以KEGG pathway[20]為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組比較后差異表達(dá)基因中顯著性富集的pathway。結(jié)果顯示AFB1以及AFB1與DON混合處理組所富集出來(lái)的pathway主要是通過(guò)P53信號(hào)通路（p＜0.01）影響細(xì)胞凋亡和周期阻滯。而DON處理組中P53信號(hào)通路并不顯著，而DON主要是影響核糖體循環(huán)這條通路（p＜0.01），阻止蛋白質(zhì)合成，對(duì)細(xì)胞造成一定程度的毒性作用。但是單獨(dú)和混合作用組都會(huì)引起JNK/c-JUN通路和P38 MAPK通路的激活，pathway分析結(jié)果與Mishra[21]和Lu[22]等研究結(jié)果一致，也有文獻(xiàn)報(bào)道真菌毒素ST會(huì)通過(guò)這些通路進(jìn)而影響細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡及DNA損傷等毒性作用[23-24]。從實(shí)驗(yàn)測(cè)序中可以看出，DON與AFB1作用于HepG2/C3A細(xì)胞的主要毒性機(jī)理并不相同，混合作用組中AFB1起主導(dǎo)作用。

3 結(jié)語(yǔ)

研究發(fā)現(xiàn)，DON和AFB1均能引起細(xì)胞增殖抑制率增加以及細(xì)胞內(nèi)總雙鏈DNA的下降，并且其混合作用強(qiáng)度均大于單獨(dú)作用效果，經(jīng)成對(duì)樣本T檢驗(yàn)分析，兩者聯(lián)合作用為加和作用，這也與之前研究結(jié)果相同[12]。Sun L.H.[25]等研究多種真菌毒素對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明AFB1與DON的聯(lián)合作用為協(xié)同作用。有人研究了由于實(shí)驗(yàn)對(duì)象的不同，從而導(dǎo)致聯(lián)合效應(yīng)的不同[26]。本研究中當(dāng)毒素作用濃度增加，引起的毒性變化不斷增強(qiáng)，均表現(xiàn)出劑量相關(guān)性。且在低濃度下會(huì)引起相應(yīng)毒性指標(biāo)的變化，引起細(xì)胞凋亡和周期阻滯，可以反映出細(xì)胞早期染毒狀態(tài)。凋亡相關(guān)基因caspase-3和Bax mRNA含量上升且Bcl-2 mRNA含量下降，進(jìn)一步說(shuō)明2毒素均能引起細(xì)胞發(fā)生凋亡并且兩者的混合作用表現(xiàn)出加和效應(yīng)。同時(shí)，通過(guò)RNA-Seq全基因測(cè)序分析，我們得到AFB1與DON作用于HepG2/C3A細(xì)胞的主要毒性機(jī)理并不相同。通過(guò)對(duì)差異基因進(jìn)行pathway的分析得出AFB1主要影響P53信號(hào)通路（p＜0.01）而DON主要影響核糖體循環(huán)這條通路（p＜0.01），阻止蛋白合成，對(duì)細(xì)胞造成一定程度的毒性作用。但是他們同時(shí)都會(huì)引起JNK/c-JUN通路和P38 MAPK通路的激活。由此我們得出AFB1與DON主要是通過(guò)2條不同的信號(hào)通路同時(shí)影響細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。從基因分子層面，研究其具體的主要凋亡途徑。為食品安全防護(hù)提供有力的保護(hù)措施。

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