腫瘤壞死因子對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖抑制作用

孫群，胡翔，胡福云

(深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院耳鼻喉科1、普外科2、外一科3，廣東深圳518108)

喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cellcarcinoma，LSCC)是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是僅次于肺癌的呼吸道癌癥[1]。LSCC好發(fā)于中老年男性，流行病學(xué)資料顯示，我國(guó)每年有3～5/10萬(wàn)新發(fā)喉癌患者，其中LSCC占96%左右，發(fā)病率占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，并且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[2]。手術(shù)、放療、化療仍為目前主要的治療手段，但是治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、化療耐受等問(wèn)題較多，術(shù)后5年生存率約為61%[3]，預(yù)后不理想，迫切需要新的治療手段。LSCC的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，近來(lái)研究認(rèn)為，其發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的過(guò)度增殖和凋亡的減少有關(guān)[4]，相關(guān)的分子靶向治療研究越來(lái)越廣泛。腫瘤壞死因子(TNF)有明確的抗腫瘤活性，也是體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)，是目前腫瘤治療常見(jiàn)的分子靶[5]，已用于腫瘤免疫及腫瘤臨床的研究，部分產(chǎn)品也已投入臨床試用。但是，TNF在LSCC中對(duì)鱗癌細(xì)胞的毒作用和機(jī)制的相關(guān)研究較少。本研究旨在探討TNF對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞株，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

1.2 藥品與試劑重組人腫瘤壞死因子α(TNF-α)，貨號(hào)：CYT-223，以色列ProSpec-Tany公司產(chǎn)品，采用RPMI-1640培養(yǎng)基配制20 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL濃度的TNF-α溶液；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(0.5%Txiton X-100)，購(gòu)自上海紫一試劑廠；0.25%胰蛋白酶消化液，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒[碘化丙啶染色法(PI)]，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒，購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司；兔抗人CDK4單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，購(gòu)自上海意杰生物科技有限公司產(chǎn)品；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)底物顯色試劑盒，購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國(guó)BD Falcon公司；J6HC離心機(jī)、CytoFLEX流式細(xì)胞儀及配套軟件，美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本三洋SANYO公司產(chǎn)品；YB12恒溫水浴箱，英國(guó)Prima公司產(chǎn)品；Awareness 2100酶標(biāo)儀，美國(guó)Awareness Technology公司產(chǎn)品；Gene genius凝膠成像儀，英國(guó)Syngene公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)取出保存于液氮罐中的人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞株凍存管，迅速置于37℃水浴鍋中，恒溫水浴，使其在1 min內(nèi)快速融化；采用無(wú)菌移液器將細(xì)胞懸液移入離心管內(nèi)，加入3 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基[含10%滅活胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素]，輕輕吹打均勻；采用1 000 r/min速度離心8 min，棄去上清液；于沉淀物中滴加10 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37℃、5%CO2相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2～3 d后，加入4 mL 0.25%胰酶消化傳代；待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)占滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底面積80%時(shí)，即處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.4.2 MTT法檢測(cè)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉鱗癌Hep-2細(xì)胞，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，將100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔滴加200 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；將培養(yǎng)孔分為對(duì)照組、用藥組，吸去培養(yǎng)基，對(duì)照組加入100 μL完全培養(yǎng)基，用藥組分別加入100 μL濃度為20 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL的TNF-α溶液，各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另外設(shè)置空白組，該組不含細(xì)胞；各培養(yǎng)孔滴加100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔滴加5 mg/mL MTT溶液(pH=7.4)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；除去上清，每孔滴加150 μL DMSO溶液，充分混勻溶解10 min后，采用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)對(duì)各培養(yǎng)孔光密度(OD值)。計(jì)算喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(用藥組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析喉鱗癌Hep-2細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的喉鱗癌Hep-2細(xì)胞，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×105個(gè)/mL，取2 mL/孔細(xì)胞懸液接種于6孔板中，同時(shí)滴加100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分為對(duì)照組、用藥組，吸去培養(yǎng)基，對(duì)照組加入100 μL完全培養(yǎng)基，用藥組分別加入100 μL濃度為20 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL的TNF-α溶液，各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，收集各培養(yǎng)孔細(xì)胞，滴加0.25%胰酶4 mL消化后制備單細(xì)胞懸液，采用離心機(jī)以1 000 r/min速度離心，5 min后除去上清液，沉淀物采用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，滴加70%乙醇5 mL固定；4℃過(guò)夜后，采用離心機(jī)以1 000 r/min速度離心，5 min后除去乙醇，PBS沖洗細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作，采用流式細(xì)胞儀分析不同時(shí)間各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。

1.4.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞中PCNA表達(dá)水平按照1.4.3中的方法培養(yǎng)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞，并進(jìn)行分組干預(yù)，取細(xì)胞懸液滴于細(xì)胞爬片上貼片30 min，置于RPMI-1640完全培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃、5%CO2相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，PBS沖洗，依次采用4%多聚甲醛處理20 min、0.5%Txiton X-100處理20 min、3%H2O2處理15 min，按照SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色，在光鏡下對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察。染色結(jié)果判定：細(xì)胞核呈棕黃色至棕褐色為染色陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：陽(yáng)性細(xì)胞率＜5%；1分：5%≤陽(yáng)性細(xì)胞率＜30%；2分：30%≤陽(yáng)性細(xì)胞率＜70%；3分：陽(yáng)性細(xì)胞率≥70%。著色程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性記0分，弱陽(yáng)性記1分，陽(yáng)性記2分，強(qiáng)陽(yáng)性記3分。PCNA表達(dá)水平=陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分+著色程度評(píng)分。

1.4.5 Western blot法檢測(cè)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞CDK4表達(dá)水平按照1.4.3中的方法培養(yǎng)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞，并進(jìn)行分組干預(yù)，滴加細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解細(xì)胞30 min，采用離心機(jī)以1 000 r/min速度離心10 min，獲得含有蛋白質(zhì)的上清液，按照BCA測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)總蛋白濃度；配制SDS-PAGE凝膠，采用SDS-PAGE凝膠分離純化蛋白質(zhì)，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉90 min，PBS沖洗3次，滴加兔抗人CDK4單克隆抗體(1:1 000稀釋)、內(nèi)參基因β-Actin抗體(1:500稀釋)，4℃過(guò)夜，PBS沖洗5 min×3次；滴加HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗5 min×3次；按照ECL顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，暗室內(nèi)X線片顯影、定影，重復(fù)三次。采用Gene genius凝膠成像儀對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行拍照、分析，測(cè)定CDK4表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均統(tǒng)一整理，應(yīng)用SPSS18.0軟件包分析，符合正態(tài)性的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間資料比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，應(yīng)用GraphPad Prism軟件繪制圖表。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖抑制率比較與對(duì)照組比較，各濃度TNF-α組在24 h、48 h喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖抑制率明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖抑制率20 pg/mL TNF-α組＜50 pg/mL TNF-α組＜100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組(P＜0.05)；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細(xì)胞增殖抑制率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖抑制率比較±s，%)

表1 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖抑制率比較±s，%)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與50 pg/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 pg/mLTNF-α組比較，cP＜0.05；與24 h比較，dP＜0.05。

組別對(duì)照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值48 h 0.00±0.00 19.27±2.33abd 34.28±4.38acd 78.87±9.26abcd 79.14±9.75abcd 25.618＜0.05例數(shù)66666 24 h 0.00±0.00 15.74±2.21ab 27.64±3.18ac 58.37±5.63abc 60.46±7.47abc 19.871＜0.05

2.2 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞凋亡率比較與對(duì)照組比較，各濃度TNF-α組在24 h、48 h喉鱗癌Hep-2細(xì)胞凋亡率明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且喉鱗癌Hep-2細(xì)胞凋亡率20 pg/mL TNF-α組＜50 pg/mL TNF-α組＜100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組(P＜0.05)；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細(xì)胞凋亡率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞細(xì)胞周期比例比較與對(duì)照組比較，各濃度TNF-α組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞S期細(xì)胞比例降低，G2/M期細(xì)胞比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，存在G2/M期細(xì)胞阻滯；且在20～100 pg/mL濃度范圍內(nèi)，TNF-α濃度越高，G2/M期細(xì)胞阻滯越嚴(yán)重(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表2 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞凋亡率比較±s，%)

表2 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞凋亡率比較±s，%)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與50 pg/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 pg/mLTNF-α組比較，cP＜0.05；與24 h比較，dP＜0.05。

組別對(duì)照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值48 h 1.79±0.19 40.65±5.14abd 62.67±7.53acd 77.56±10.34abcd 78.15±10.17abcd 29.785＜0.05例數(shù)66666 24 h 1.74±0.21 34.27±4.23ab 53.23±6.04ac 64.57±7.74abc 65.24±7.42abc 25.693＜0.05

表3 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞細(xì)胞周期比例比較(±s，%)

表3 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞細(xì)胞周期比例比較(±s，%)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與50 pg/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 pg/mLTNF-α組比較，cP＜0.05。

組別例數(shù)細(xì)胞周期對(duì)照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值66666 G0/G1期68.84±3.36 67.63±4.35 66.74±4.83 62.85±3.84a 62.28±3.68ac 5.314＜0.05 S期22.58±2.85 19.53±1.56ab 16.73±1.75ac 13.66±2.18abc 13.35±1.47abc 12.864＜0.05 G2/M期7.16±0.94 11.63±1.03ab 18.64±1.47ac 25.36±2.17abc 25.75±2.05abc 17.548＜0.05

2.4 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞PCNA表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，各濃度TNF-α組在24 h、48 h喉鱗癌Hep-2細(xì)胞PCNA表達(dá)水平明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且喉鱗癌Hep-2細(xì)胞PCNA表達(dá)水平20 pg/mL TNF-α組＞50 pg/mL TNF-α組＞100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組(P＜0.05)；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細(xì)胞PCNA表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞PCNA表達(dá)水平比較(±s，%)

表4 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞PCNA表達(dá)水平比較(±s，%)

組別對(duì)照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值例數(shù)66666 24 h 5.26±0.64 3.87±0.24ab 1.66±0.18ac 0.84±0.07abc 0.81±0.06abc 18.649＜0.05 48 h 5.24±0.61 3.11±0.22abd 1.05±0.13acd 0.52±0.04abcd 0.49±0.04abcd 12.564＜0.05

2.5 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞CDK4活性比較與對(duì)照組比較，各濃度TNF-α組在24 h、48 h喉鱗癌Hep-2細(xì)胞CDK4活性明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且喉鱗癌Hep-2細(xì)胞CDK4活性20 pg/mL TNF-α組＞50 pg/mL TNF-α組＞100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組(P＜0.05)；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細(xì)胞CDK4活性較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表5和圖1。

表5 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞CDK4活性比較s)

表5 各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞CDK4活性比較s)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與50 pg/mL TNF-α組比較，bP＜0.05；與20 pg/mLTNF-α組比較，cP＜0.05；與24 h比較，dP＜0.05。

組別對(duì)照組20 pg/mLTNF-α組50 pg/mLTNF-α組100 pg/mLTNF-α組200 pg/mLTNF-α組F值P值48 h 0.82±0.08 0.61±0.07abd 0.49±0.05acd 0.15±0.02abcd 0.14±0.02abcd 10.254＜0.05例數(shù)66666 24 h 0.83±0.09 0.72±0.08ab 0.56±0.06ac 0.21±0.03abc 0.20±0.03abc 9.687＜0.05

圖1 Western blot法檢測(cè)各組喉鱗癌Hep-2細(xì)胞CDK4活性的圖像

3 討論

LSCC是最常見(jiàn)的喉癌類(lèi)型，臨床上以聲嘶、呼吸困難、咳嗽、吞咽異常等癥狀為主要表現(xiàn)，吸煙、飲酒、空氣污染、長(zhǎng)期接觸有毒化學(xué)物質(zhì)及放射線、病毒感染、性激素、微量元素缺乏等是引起該病常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素[6-7]。近年來(lái)隨著吸煙人口增多、環(huán)境污染嚴(yán)重等發(fā)病率及死亡率不斷上升，給患者造成很大痛苦，給社會(huì)也造成了沉重負(fù)擔(dān)。LSCC的治療以手術(shù)、化療、放療等為主，首次治療后易發(fā)生局部復(fù)發(fā)，還有可能對(duì)抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致患者預(yù)后較差[8]，因此，尋找更為安全有效的治療手段尤為重要。

TNF又被稱(chēng)為惡液質(zhì)素，是由體內(nèi)活化的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子，也是首個(gè)用于腫瘤生物療法的細(xì)胞因子，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。TNF有明確的抗腫瘤活性，能夠通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡、增強(qiáng)宿主免疫功能、抗腫瘤新生血管形成、誘導(dǎo)腫瘤血管功能紊亂等機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[9-10]。研究顯示，TNF對(duì)多種惡性腫瘤有較好的效果，能提高常規(guī)化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌的療效[11]，還對(duì)MKN45胃癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)有顯著的增殖抑制作用[12]。但是，目前關(guān)于TNF在LSCC中作用的相關(guān)研究較少。本次選擇人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，分為對(duì)照組和藥物組，分別采用0 pg/mL、20 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL TNF-α溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)24 h及48 h后，采用MTT法觀察各組細(xì)胞的增殖，F(xiàn)CM法檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期比例分布。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各濃度TNF-α組Hep-2細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率較高，且20 pg/mL TNF-α組＜50 pg/mLTNF-α組＜100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率較高(P＜0.05)，表明TNF能夠有效抑制人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且在20～100 pg/mL范圍內(nèi)，藥物濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用和促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用越強(qiáng)，具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。本研究中不同濃度TNF細(xì)胞增殖的抑制的相關(guān)研究既往尚不多見(jiàn)，這也是研究的創(chuàng)新之處，也提示TNF可能對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌的治療存在一定的臨床意義。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞不受控制的進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)和快速?gòu)?fù)制，是惡性腫瘤細(xì)胞不斷分裂增殖的原因之一，干預(yù)腫瘤細(xì)胞周期，防止其進(jìn)入分裂期是治療腫瘤的手段之一。G1/S期和G2/M期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[13]，將細(xì)胞阻滯于此周期可延緩細(xì)胞分裂進(jìn)程，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各濃度TNF-α組Hep-2細(xì)胞S期細(xì)胞比例較低，G2/M期細(xì)胞比例較高；且在20～100 pg/mL濃度范圍內(nèi)，TNF-α濃度越高，G2/M期細(xì)胞阻滯越嚴(yán)重(P＜0.05)，表明TNF-α能有效干預(yù)腫瘤細(xì)胞周期，將人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞阻滯于G2/M期，減少細(xì)胞增殖，從而防治腫瘤進(jìn)展。另一方面，PCNA也參與細(xì)胞增殖過(guò)程，其為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，主要由細(xì)胞核合成，與DNA合成關(guān)系密切，可以加速DNA合成速度，啟動(dòng)細(xì)胞增殖過(guò)程。另外，PCNA還能協(xié)同調(diào)控DNA修復(fù)、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞凋亡等多個(gè)過(guò)程，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。有研究認(rèn)為，PCNA在LSCC中異常表達(dá)[14]。CDK4屬于核內(nèi)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白之一，其含量在各細(xì)胞周期中相對(duì)穩(wěn)定，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和分裂，在LSCC中呈高表達(dá)狀態(tài)，可以推動(dòng)LSCC進(jìn)展，能夠用于判斷患者預(yù)后[15]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各濃度TNF-α組Hep-2細(xì)胞PCNA表達(dá)水平及CDK4活性較低；且20 pg/mL TNF-α組＞50 pg/mL TNF-α組＞100 pg/mL TNF-α組和200 pg/mL TNF-α組；與24 h比較，相同濃度TNF-α作用48 h后Hep-2細(xì)胞PCNA表達(dá)水平及CDK4活性較低(P＜0.05)，表明TNF能劑量和時(shí)間依賴(lài)性地下調(diào)PCNA表達(dá)水平及CDK4活性，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，起到抗腫瘤和改善預(yù)后作用。

綜上所述，TNF對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖具有抑制作用，能夠使細(xì)胞阻滯于G2期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用可能與下調(diào)PCNA表達(dá)水平和CDK酶活性有關(guān)。因此，本研究可能為喉鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療提供了新的研究方向，有望探索出新的治療有效方法。

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