兔巴氏桿菌病病原菌的分離及生物學(xué)特性的鑒定

鄭麗麗，楊 威 ，逯紀(jì)成，孟 艷 ，楊旭光，王 邁 ，楊聰偉

（1.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000；2.保定市動物疫病預(yù)防控制中心，河北 保定 071000；3.衡水市動物疫病預(yù)防控制中心，河北 衡水 053000；4.石家莊市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北石 家莊 050000；5.衡水市饒陽縣畜牧局，河北 衡水 053000）

兔巴氏桿菌?。≧abbit Pasteurellosis）是由多殺性巴氏桿菌引起的，也是一種人畜共患的傳染病。多殺性巴氏桿菌分布廣，常以帶菌狀態(tài)寄生于家兔的呼吸道粘膜及扁桃體，兔的帶菌率為35%～70%。該病在各種年齡階段的兔中均有發(fā)生，更易感染幼齡或體質(zhì)虛弱的家兔。該病一年四季均可發(fā)生,特別是在氣溫驟變、潮濕、悶熱、通風(fēng)不良飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)炔涣紤?yīng)激情況下最易發(fā)生。如遇急性暴發(fā)可造成兔群的大批死亡。慢性感染則會由于難以根治造成疫情纏綿不斷，時常發(fā)生，損失嚴(yán)重。

2017年8 月，保定市某縣農(nóng)戶飼養(yǎng)1000多只獺兔，發(fā)病兔50只，死亡13只。通過流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀、剖檢特征、實驗室診斷、確診為多殺性巴氏桿菌感染?，F(xiàn)將具體情況報告如下：

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基本實驗室提供

1.2 試驗方法

1.2.1 臨床癥狀 病兔表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、體溫升高，眼結(jié)膜發(fā)紅，流出漿液性分泌物。并且不停的甩鼻、打噴嚏，從鼻孔中不斷流出漿液性或黏液膿性分泌物，在鼻孔外周結(jié)痂。由于病兔常用前爪去抓鼻子，使鼻孔外面的被毛凌亂、脫落。個別兔拉稀糞或白色粘液便。病情嚴(yán)重的逐漸衰弱消瘦造成生長停止或死亡。

1.2.2 病理變化 各漿膜、粘膜、臟器有大小不等的出血點，氣管和鼻腔充血、水腫，有黏液性或膿性分泌物；胸腔積液，胸膜、肺、心包膜上有纖維素絮片；肺臟、肝臟、脾臟有不同程度的水腫、出血，腎臟有出血點；胃腸粘膜充血、出血。

1.2.3 細(xì)菌的分離、篩選、純化 無菌取病死兔的肝臟、脾臟和鼻、咽棉拭子，接種營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂培養(yǎng)基，分別在有氧和無氧條件下培養(yǎng)，經(jīng)37℃培養(yǎng)24～48h后取可疑菌落劃線于血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48h后取可疑菌落抹片、革蘭氏染色鏡檢。

1.2.4 分離菌的鑒定

1.2.4.1 革蘭氏染色 將分離的可疑菌落進行涂片，分別進行革蘭氏染色和運動力檢查。

1.2.4.2 細(xì)菌三糖鐵試驗 將典型可疑菌落接種于三糖鐵瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24h觀察顏色變化。

1.2.4.3 菌落PCR特征鑒定 用1mL分離純化并過夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液，用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進行基因組DNA提?。ㄙ徲谏ど锕こ蹋ㄉ虾＃┯邢薰荆?，根據(jù)設(shè)計的細(xì)菌鑒定通用引物（見表1）及相應(yīng)的PCR操作程序，對初步鑒定的細(xì)菌進行PCR擴增。收集擴增后的產(chǎn)物，進行測序，并通過基因Bank的BLAST進行比對、鑒定。

表1 菌種鑒定通用引物

1.3 結(jié) 果

1.3.1 分離菌的分離鑒定 分離菌無論在有氧或無氧的條件下均可以生長，說明此菌為需氧及兼性厭氧菌。在各種培養(yǎng)基上的表現(xiàn)為：營養(yǎng)瓊脂有菌落生長，呈灰白色、半透明、露珠樣小菌落，表面光滑，邊緣整齊；在血瓊脂平板上長成周圍不溶血、水滴樣和濕潤小菌落；接種于麥康凱培養(yǎng)基上不生長，鏡檢為革蘭氏陰性菌（如圖1）?；痉隙鄽⑿园褪蠗U菌的基本特征。

圖1 菌落形態(tài)

1.3.2 分離菌的染色 革蘭氏染色可見到兩端鈍圓、中央微凸的球桿菌。不形成芽孢，無鞭毛，不運動，有莢膜，呈兩極著色的革蘭氏陰性菌。

1.3.3 三糖鐵試驗 三糖鐵試驗結(jié)果：斜面培養(yǎng)基變黃，底層變黃，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

1.3.4 PCR擴增及測序鑒定結(jié)果 對分離到的疑似菌株進行PCR擴增，在1500bp處得到有一條特異性條帶。收集擴增產(chǎn)物，進行測序并通過BLAST進行比對，鑒定結(jié)果為多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida subsp.septica）。（見圖2、3）

1.4 小結(jié)與討論

1.4.1 根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化，細(xì)菌培養(yǎng)、三糖鐵檢測及菌落PCR鑒定，確診本病為由兔巴氏桿菌引起的疾病。

（圖2）細(xì)菌DNA ITS擴增產(chǎn)物大小在1500bp左右

1.4.2 結(jié)果顯示，該菌株具有較強的致病性，屬于條件致病菌。發(fā)病動物和帶菌動物是本病的主要傳染源。當(dāng)飼養(yǎng)條件不佳、氣候環(huán)境劇變、通風(fēng)不良、營養(yǎng)不佳、應(yīng)激因素和寄生蟲的侵害等誘因作用下，使其抗病力下降時，易感染發(fā)病。因此，該病應(yīng)以預(yù)防為主，治療為輔的防制措施。加強飼養(yǎng)管理，根據(jù)當(dāng)?shù)乇静〉牧餍星闆r和養(yǎng)殖場實際情況，制定本場的免疫程序，增強兔的特異性免疫力。

圖3 測序結(jié)果和比對結(jié)果