獸用煙酸阿莫西林可溶性粉的安全性試驗(yàn)

孟冬霞 ，武果桃 ，任 杰，衛(wèi)順生 ，孟 帆，趙 娟，馬政禹，劉曉東，夏艷婷

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 晉中 030801；3.甘肅省武鄉(xiāng)縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山西 武鄉(xiāng) 046300）

阿莫西林屬半合成廣譜抗生素，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而起抗菌作用。用于敏感菌所致的肺部、尿道感染和革蘭氏桿菌引起的某些感染等，例如牛巴氏桿菌病、乳腺炎、肺炎，犢、駒肺炎，豬傳染性胸膜肺炎，雞白痢、禽傷寒等。對腸球菌屬和沙門氏菌的作用較氨芐西林強(qiáng)2倍。但由于阿莫西林水溶性不好，臨床應(yīng)用時易造成藥物損失，無形中增加養(yǎng)殖成本。煙酸阿莫西林可溶性粉是由煙酸和阿莫西林研制而成的一種新型獸藥制劑，提高了阿莫西林的溶解度和生物利用度，在獸醫(yī)臨床中有廣闊的應(yīng)用前景。為保證其在獸醫(yī)臨床中的安全應(yīng)用，選用昆明系小鼠灌胃給藥進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)、清潔級SD大鼠灌胃給藥進(jìn)行亞急性毒性試驗(yàn)，為臨床用藥奠定理論基礎(chǔ)，為開展藥效學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物

煙酸原料藥，含量99.8%，批號120203，天津中瑞藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；阿莫西林原料藥，華北制藥集團(tuán)先泰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：101150510112；煙酸阿莫西林可溶性粉，為課題組自行研制而成，使用時用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度。

1.2 主要試劑

羧甲基纖維素鈉，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，批號：20130821；大、小鼠飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)，批號：16043211、16063211；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（批號P1502011）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號P1506011）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（批號P1504021）、尿素（BUN）試劑盒（批號 P1411011）、尿酸（UA）試劑盒（批號P1412021）、肌酐（CREA）試劑盒（批號D1507091）、白蛋白（ALB）試劑盒（批號 L1505013）、總蛋白（TP）試劑盒（批號L1508013），試劑盒均為上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器

JMB30001型電子天平；石蠟包埋機(jī)，Histocentre 3，英國Shandon；石蠟切片機(jī)，F(xiàn)inesse 325，英國 Shandon；全自動組織脫水機(jī)，Excelsior，英國Shandon；熒光顯微成像系統(tǒng)，BX53，日本Olympus公司；Konelab PRIME 30全自動生化分析儀（美國Thermo Fisher公司）；HEMAVET 950全自動五分類動物血液分析儀（美國Drew Scientific公司）。JEM 1011顯微鏡。

1.4 試驗(yàn)動物

清潔級昆明系小鼠100只，體重18～22g，雌雄各50只，購自山西省腫瘤醫(yī)院；清潔級SD大鼠40只，體重150～190g，雌雄各20只，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；動物環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀察期為5d，檢疫期內(nèi)小鼠及大鼠皮毛光滑、行為及外觀正常、無異常分泌物等，未發(fā)現(xiàn)異常動物。灌胃前14h禁食、不禁水，灌胃后3～4h恢復(fù)正常進(jìn)食，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 飼養(yǎng)條件

飼養(yǎng)室溫度21.0±0.5℃,濕度66.7±3.9%，12h照明，12h黑暗。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠內(nèi)飼養(yǎng),每籠5只,每周換籠2次。每日作業(yè)結(jié)束后清掃，擦拭籠架、臺面，每周五用消毒液擦拭消毒，每周輪流更換消毒劑種類。墊料，大廠回族自治縣陳府伊甸園墊料加工廠生產(chǎn)，經(jīng)中國輻射防護(hù)研究院輻照中心鈷-60輻照滅菌后使用。飲水，由飲水瓶供應(yīng)經(jīng)高壓滅菌的自來水，自來水經(jīng)國家城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)太原監(jiān)測站檢驗(yàn)（檢測報(bào)告編號：W2015723），符合《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB5749-2006）要求。每日更換飲水瓶，飲水瓶經(jīng)清洗、高壓滅菌后使用。

2 方法

2.1 急性毒性試驗(yàn)

2.1.1 預(yù)試驗(yàn) 用改良冠氏法進(jìn)行LD50測定。取60只小鼠，隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各5只。各組小鼠分別按0.2mL/10g·bw的劑量灌服相應(yīng)濃度的受試藥液。受試藥液濃度 分 別 為 1000mg/kg.bw、1500mg/kg.bw、2000mg/kg.bw、3000mg/kg.bw、5000 mg/kg.bw，空白組灌服同等劑量的蒸餾水。連續(xù)觀察7d，記錄小鼠的精神狀態(tài)、食欲、活動狀況、呼吸、糞便及死亡情況。第8d每組隨機(jī)取2只處死剖檢觀察臟器、體腔積液等病理變化。

2.1.2 正式試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。選取40只小鼠，隨機(jī)分為2組，每組20只，雌雄各半，試驗(yàn)組用5000mg/kg.bw灌胃給藥1d，連續(xù)觀察7d，詳細(xì)記錄小鼠反應(yīng)情況。在觀察期間保證食、水、溫度等生活條件，嚴(yán)防非試驗(yàn)因素引起的死亡。第8d各組隨機(jī)剖解2只，觀察臟器病理變化。

2.2 亞急性毒性試驗(yàn)

將清潔級SD大鼠40只隨機(jī)分為高、中、低劑量組及對照組，每組10只，雌雄各半，1～3組為試驗(yàn)組，每天同一時間灌胃給藥，藥物濃度分別為4800mg/kg.bw、2400mg/kg.bw、1200mg/kg.bw，4組為對照組，灌服蒸餾水。連續(xù)給藥28d，觀察并記錄大鼠的生理行為，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動狀況、被毛光澤度腺體分泌、糞便性狀及體重增長情況。在觀察期間保證食、水、溫度等生活條件，嚴(yán)防非試驗(yàn)因素引起的死亡。給藥結(jié)束時各組隨機(jī)取5只大鼠用水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，進(jìn)行血常規(guī)檢驗(yàn)、血清生化指標(biāo)測定，并進(jìn)行解剖肉眼觀察各臟器顏色、形狀、大小等組織病變情況。取肝、雙腎稱重，計(jì)算臟器系數(shù)（臟器重量g/體重g）；并每組隨機(jī)選3只大鼠進(jìn)行肝、腎病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)檢查。各組剩余的5只大鼠停止給藥，進(jìn)行恢復(fù)期試驗(yàn)。常規(guī)飼養(yǎng)10d，進(jìn)行血常規(guī)檢驗(yàn)、血清生化指標(biāo)檢測、臟器系數(shù)計(jì)算；每組隨機(jī)取3只大鼠進(jìn)行肝腎病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)檢查。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

血液學(xué)指標(biāo)：采用HEMAVET 950全自動五分類動物血液分析儀（美國 Drew Scientific公司）測定，測定方法見表2；血液生化指標(biāo)均采用Konelab PRIME 30全自動生化分析儀（美國Thermo Fisher公司）測定，檢測指標(biāo)包括堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素、尿酸、肌酐、白蛋白及總蛋白，測定方法見表3。

2.4 組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)檢查

試驗(yàn)結(jié)束后各組隨機(jī)選取3只大鼠迅速剖殺，采集肝、腎參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)檢查。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ANOVA程序進(jìn)行方差分析和鄧肯氏(Duncan)多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 小白鼠給藥7d內(nèi)，各組精神狀態(tài)良好，口及肛門無異常分泌物，皮毛潔凈，呼吸正常，食欲及活動狀態(tài)未見異常，未見中毒癥狀和死亡。測不出LD50。各組隨機(jī)取2只小鼠處死進(jìn)行病理剖檢，未出現(xiàn)眼觀病理變化。

3.1.2 最大給藥量試驗(yàn)結(jié)果 小鼠經(jīng)最大劑量5000mg/kg灌胃給藥后，精神狀態(tài)良好，被毛光澤潔凈，采食、飲水、排便、排尿等均無異常，口、鼻、眼均無異常分泌物，無死亡現(xiàn)象。7d后各組隨機(jī)剖檢2只，均未見臟器有異常病理變化，

故LD50＞5000mg/kg。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道LD50為5000mg/kg時認(rèn)為無毒性，故表明煙酸阿莫西林可溶性粉急性毒性分級屬低毒級。

表1 煙酸阿莫西林對大鼠體重的影響

表2 煙酸阿莫西林對大鼠血液生理指標(biāo)的影響（n=5）

表3 煙酸阿莫西林對大鼠血液生化指標(biāo)及臟器系數(shù)的影響（n=5）

圖1 對照組 肝臟組織切片HE×200

圖2 對照組 肝臟組織切片HE×200

圖3 高劑量肝臟組織切片肝臟中央靜脈擴(kuò)張，周圍肝細(xì)胞腫脹 HE×200

圖4 中劑量肝臟組織切片肝臟枯否氏細(xì)胞增生 HE×200

圖5 高劑量組腎臟組織切片腎小球內(nèi)細(xì)胞增生 HE×200

圖6 中劑量組肝臟組織切片局部間質(zhì)血管周圍炎性細(xì)胞浸潤HE×200

圖7 對照組肝臟超微結(jié)構(gòu)線粒體正常、嵴排列整齊，內(nèi)外膜完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列規(guī)則

圖8 對照組腎臟超微結(jié)構(gòu)微絨毛排列整齊

圖9 高劑量組肝臟超微結(jié)構(gòu)核規(guī)律，內(nèi)外膜完整，線粒體形狀規(guī)則，部分嵴斷裂

圖10 中劑量肝臟超微結(jié)構(gòu)核完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，個別線粒體變形，雙層膜完整，少部分嵴斷裂

圖11 高劑量組腎臟超微結(jié)構(gòu)核外膜腫脹，線粒體部分空泡化嵴斷裂

圖12 中劑量組肝臟超微結(jié)構(gòu)核膜腫脹，微絨毛邊緣有脫落現(xiàn)象

3.2 亞急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 煙酸阿莫西林對大鼠生理行為及體重變化影響 試驗(yàn)組大鼠灌胃給藥后生長良好，口、鼻、眼均無異常分泌物、體溫、呼吸、脈博及排便均正常，飲食情況、精神狀態(tài)、活動狀況和被毛光澤度等與對照組無顯著差異。給藥期間，大鼠未出現(xiàn)死亡。體重變化情況見表1，由表1可知，各組大鼠均有不同幅度的體重增加，給藥28d時，對照組及高、中、低劑量組分別增重 109.2g，101.5g、106g、108.9g，各試驗(yàn)組大鼠體重變化幅度與對照組相比，差異均不顯著（p＞0.05）；停藥10d時，對照組及高、中、低劑量組分別增重130.5g、126.7g、126.4g、129.2g，各試驗(yàn)組大鼠體重變化幅度與對照組相比，差異均不顯著（p＞0.05）。

3.2.2 煙酸阿莫西林對大鼠血液生理指標(biāo)的影響 血常規(guī)測定結(jié)果見表2。由表2可知，給藥28d時，高劑量組白細(xì)胞顯著低于對照組（p＜0.05），其余各組檢測指標(biāo)與對照組相比，差異均不顯著（p＞0.05）。停藥10d時，各組檢測指標(biāo)與對照組相比差異均不顯著（p＞0.05）。表明長期大劑量口服煙酸阿莫西林可引起白細(xì)胞降低，但此不良反應(yīng)在停藥后即可消失。

3.2.3 煙酸阿莫西林對大鼠血液生化指標(biāo)及臟器系數(shù)的影響 血液生化指標(biāo)及肝、腎臟器系數(shù)測定結(jié)果見表3。由表3可知，給藥28d時，高、中劑量組堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、總蛋白均顯著低于對照組（p＜0.05）；其它指標(biāo)各試驗(yàn)組與對照組相比差異均不顯著（p＞0.05）；停藥10d時，各組生化檢測指標(biāo)及肝、腎臟器系數(shù)與對照組相比差異均不顯著（p＞0.05）。表明長時間大劑量用藥，對肝、腎均有一定的影響，但這種影響停藥后即可消失。

3.2.4 煙酸阿莫西林對大鼠病理組織變化及超微結(jié)構(gòu)的影響 給藥28d，各組隨機(jī)剖解3只，心、肝、脾、肺、腎、胃和腸的形態(tài)、顏色、質(zhì)地均未見異常。正常肝、腎組織切片見，高、中劑量組肝臟組織切片。高、中劑量組腎臟組織切片；正常肝、腎超微結(jié)構(gòu)。高、中劑量組肝臟超微結(jié)構(gòu)。高、中劑量組腎臟臟超微結(jié)構(gòu)。停藥10d，肝、腎組織切片及超微結(jié)構(gòu)均未見異常。

4 討論

4.1 急性毒性試驗(yàn)是安全性評價(jià)的重要內(nèi)容。在本試驗(yàn)中，以最大給藥濃度5g/kg.bw一次給藥，小鼠無死亡現(xiàn)象，根據(jù)新獸藥一般毒性試驗(yàn)技術(shù)要求，可初步判定煙酸阿莫西林毒性較低，較安全。

4.2 亞急性毒性試驗(yàn)過程中，連喂28d，大鼠的飲食、行為、排泄、精神狀態(tài)、活動狀況和被毛光澤度等與對照組無顯著差異，體重也隨天數(shù)增加而增加，增加幅度與對照組相比，差異不顯著（p＞0.05），表明煙酸阿莫西林對大鼠生長發(fā)育無抑制作用。

4.3 血液成份的檢測是檢驗(yàn)藥物毒性的一個重要指標(biāo)。連續(xù)給藥28d，高劑量組大鼠白細(xì)胞顯著低于對照組（p＜0.05），停藥10d，則差異不顯著（p＞0.05）。表明長期大劑量服用煙酸阿莫西林可引起白細(xì)胞降低，但停藥后即可恢復(fù)正常。

4.4 谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、白蛋白、總蛋白是檢查肝功能的重要指標(biāo)。尿素氮、尿酸、肌酐是檢查腎功能的主要指標(biāo)。通過對大鼠給藥后血液生化指標(biāo)的測定，可以判斷藥物對機(jī)體臟器的毒性作用情況。動物的臟器重量與臟器指數(shù)是生物醫(yī)學(xué)研究的重要基礎(chǔ)指標(biāo)，動物臟器重量與其指數(shù)的測定，既能反映臟器本身的結(jié)構(gòu)改變，同時還可以反映生理性功能狀態(tài)，如免疫功能、生殖功能等。臟器系數(shù)增大，反映該臟器腫大，病變可能為增生、充血、水腫等；臟器系數(shù)變小，可能反映臟器發(fā)育不良或萎縮等變化。不僅對動物飼養(yǎng)管理和生理狀態(tài)具有指導(dǎo)意義，而且是進(jìn)行毒理學(xué)、病理學(xué)研究和探討發(fā)病機(jī)理等研究時選擇動物的依據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠長期大劑量使用該藥，對心、肝、脾、肺、腎、胃和腸的形態(tài)、顏色、質(zhì)地及肝、腎臟器系數(shù)影響不明顯，對肝、腎代謝有一定的影響，但停藥10d后不良反應(yīng)即可消除。

4.5 臟器形態(tài)結(jié)構(gòu)改變將直接影響機(jī)體的正常功能。本試驗(yàn)通過組織切片及電鏡檢查，為肝、腎細(xì)胞早期損傷的形態(tài)學(xué)改變提供依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，長期大劑量使用，可對肝、腎有一定的損傷，但這種損傷可以通過機(jī)體自身恢復(fù)。

綜上所述，無論從血液、生化指標(biāo)還是從組織切片、電鏡超微結(jié)構(gòu)來看，長期大劑量使用煙酸阿莫西林對肝、腎均有一定的影響，建議臨床使用時注意控制藥物劑量和使用時間。

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