紫外分光光度法測(cè)定西藏林芝當(dāng)歸根中總黃酮含量△

李　捷　陳依春　賀　學(xué)　王世華　張景瑜　吳曉軍　張雪偉　姚　歡　巴桑次仁　色里瑪　孫芳云*

(1.西藏民族大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室、藏藥篩選實(shí)驗(yàn)室，陜西　咸陽(yáng)　712082;　2.西藏甘露藏藥股份有限公司，西藏　拉薩　851400)

當(dāng)歸,藏名當(dāng)庚,為傘形科植物當(dāng)歸的干燥根，生長(zhǎng)于海拔2800～4900m高寒陰濕的山坡及林緣，《藏醫(yī)百科全書(shū)》記載,藥性味辛性涼。據(jù)初步考證西藏當(dāng)歸分布于林芝、昌都、拉薩、日喀則、那曲等地?！毒е楸静荨酚涊d：當(dāng)庚清心熱，解毒。藏醫(yī)藥記載，西藏當(dāng)歸是傳統(tǒng)藏藥，有補(bǔ)血、養(yǎng)血滋補(bǔ)、活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛等作用。

當(dāng)歸的化學(xué)成分主要有多糖類、苯酞類、香豆素類、阿魏酸鈉、黃酮類、揮發(fā)油類化合物及其他成分[1-2]。黃酮類化合物是其主要有效成分之一，黃酮類化合物泛指2個(gè)具有酚輕基的苯環(huán)通過(guò)中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物[3]。有研究表明,黃酮類化合物有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、降血脂作用[4]。實(shí)驗(yàn)表明，從當(dāng)歸中分離到的黃酮類化合物具有抑制NO生成、抗氧化和抑菌殺菌等作用[5-7]。西藏當(dāng)歸中是否含有黃酮類物質(zhì)未見(jiàn)報(bào)道，我們利用西藏林芝種植當(dāng)歸根,對(duì)其總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，為進(jìn)一步研究西藏當(dāng)歸的藥理作用提供理論依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器紫外分光光度計(jì)(美國(guó)PE lambda-25)，電子分析天平(T-214萬(wàn)分天平)，超聲提取儀(型號(hào)HAD-SY-800，長(zhǎng)春樂(lè)璞科技有限公司)，低溫室不銹鋼藥品柜(SC18CM4門(mén)冰箱)。

1.2試劑蘆丁對(duì)照品(供UV法含量測(cè)定用)：100080-201610，100mg/支，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。三氯化鋁：AR，20161008，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉：分析純，20161020，河南焦作市化工三廠；氫氧化鈉：分析純，西安化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇：分析純，20160626，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.3藥材西藏林芝2017年當(dāng)歸根，由西藏甘露藏藥廠提供。

2　方法與結(jié)果

2.1林芝當(dāng)歸根總黃酮的提取工藝精密稱取西藏林芝2017年當(dāng)歸根粗粉1g, 置于500mL圓底燒瓶, 加入75%酒精60mL和玻璃珠少許，浸泡20min后，加熱保持沸騰回流1h，冷卻后抽濾得濾液，濾渣再次加入60mL 75%酒精浸泡20min后沸騰回流1h ，冷卻抽濾，合并兩次濾液。將濾液水浴濃縮至僅剩5mL，轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，用75%酒精稀釋定容至刻度，得樣品提取原液。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品28.66mg，置25mL容量瓶中, 用無(wú)水乙醇定容。精密量取10.00 mL蘆丁對(duì)照品溶液于50mL容量瓶, 用無(wú)水乙醇稀釋、定容,搖勻即得蘆丁對(duì)照品溶液(0.22928mg/mL)。

2.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇精密移取對(duì)照品溶液2.00mL置25mL容量瓶中,按順序依次加入5%NaNO2溶液1mL，搖勻,放置6min,加10% AlCl3溶液1mL搖勻,放置6min,再加入4% NaOH溶液10mL,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻，放置15min。精密移取蒸餾水2.00mL，同法配制25mL混合溶液作為空白對(duì)照,在200～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,確定蘆丁顯色液的最大吸收波長(zhǎng)為509nm。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密移取蘆丁對(duì)照品溶液1.00mL， 2.00mL， 3.00mL， 4.00mL，5.00mL， 6.00mL,分別置于25mL容量瓶中，按順序依次加入5%NaNO2溶液1mL，搖勻,放置6min,加10% AlCl3溶液1mL搖勻,放置6 min,再加入4% NaOH溶液10mL,并加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻，放置15min。在波長(zhǎng)為509nm處進(jìn)行檢測(cè)，然后以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最小二乘法直線回歸，得蘆丁回歸方程為:A=13.324·C-0.1253，A 為吸光度，C為質(zhì)量濃度，R2=0.9984，n=5。實(shí)驗(yàn)表明蘆丁在9.17～55.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)精密量取配置好的西藏林芝2017年當(dāng)歸根樣品溶液2.00mL，其余同2.3項(xiàng)下操作,測(cè)定吸光度,重復(fù)測(cè)定6次,結(jié)果表明,RSD=1.9%,說(shuō)明該方法精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取配置好的西藏林芝2017年當(dāng)歸根樣品溶液2.00mL，其余同2.3項(xiàng)下操作,每隔15min測(cè)定一次吸光度,重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果表明,樣品吸光度在60min內(nèi)穩(wěn)定，RSD=2.1%，說(shuō)明該方法穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)平行取西藏林芝2017年當(dāng)歸根藥材粉末1g各5份，按2.1項(xiàng)下方法制備樣品原液。精密量取2.00mL，其余同2.3項(xiàng)下操作,測(cè)定吸光度,林芝根RSD=2.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8回收率試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液(濃度為0.1mg/mL)0.2mL,0.3mL各2份,置25mL容量瓶中，分別加入已知含量的西藏林芝根(已測(cè)得其總黃酮含量為2.53mg/mL)樣品溶液2.00mL,其余按2.3項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定回收率為101.5%，RSD=0.8%，表明該方法科學(xué)合理。

3　樣品含量測(cè)定結(jié)果

取西藏林芝2017年當(dāng)歸根藥材粉末1g，按2.1項(xiàng)下方法制備樣品溶液。精密移取林芝根樣品原液2.00mL，其余按2.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,代入回歸方程中。

樣品中總黃酮含量計(jì)算公式：由線性方程A=13.324·C-0.1253得出。西藏林芝2017年當(dāng)歸根莖中總黃酮的含量測(cè)定分別為2.653 mg/g 、2.668 mg/g、2.534 mg/g、2.530 mg/g、2.633 mg/g ，總黃酮均值計(jì)算為2.604mg/g。

4　討論

有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)歸總黃酮提取工藝中，乙醇回流法為當(dāng)歸總黃酮的最適提取方法[8]。本人利用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室條件，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，經(jīng)全波長(zhǎng)掃描確定最大吸收波長(zhǎng)分別為509 nm，在9.17～55.0μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為: A=13.324·C-0.1253, R2=0.9984,n=5, A為吸光度，C為質(zhì)量濃度，總黃酮回收率為101.5%，在該工藝條件下提取林芝當(dāng)歸總黃酮，得當(dāng)歸總黃酮含量為2.604mg/g。

本研究采用紫外分光光度法回對(duì)西藏林芝當(dāng)歸根中總黃酮進(jìn)行測(cè)定，方法學(xué)考察顯示，該方法顯色穩(wěn)定，重復(fù)性、精密度及回收率均達(dá)到定量分析的要求，且簡(jiǎn)便易行，數(shù)據(jù)較為合理可靠，可用于當(dāng)歸藥材的日常檢驗(yàn)和質(zhì)量控制。