類激素小肽在花生脅迫應答中的應用與展望

徐 揚，成 波，丁 紅，慈敦偉，秦斐斐，張智猛

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

花生作為重要的油料和經(jīng)濟作物，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位[1]?；ㄉ哂锌购怠⒛婉?、適應性強、中度耐鹽堿等特點，是鹽堿、干旱等地區(qū)較適宜種植的作物[2]，但惡劣環(huán)境仍會制約花生產(chǎn)量和質(zhì)量的提高。因此，如何在逆境環(huán)境條件下實現(xiàn)花生產(chǎn)量的增長是亟需解決的問題。傳統(tǒng)育種方法周期長、效率低、發(fā)展緩慢，而花生轉(zhuǎn)基因研究成果相當匱乏。因此，探討既可提高花生對環(huán)境脅迫的耐受能力，還可彌補傳統(tǒng)育種長周期的研究途徑具有重要意義。

植物作為固著生長的物種，不可避免地會暴露于諸如細菌、真菌、病毒、干旱、鹽堿、高低溫等各種生物和非生物脅迫環(huán)境下。植物通過復雜的信號途徑來感知外界的環(huán)境變化，通過體內(nèi)的信號交流，最終增強其自身的耐受性[3-4]，這個過程包括兩種情況，葉片和根部之間的長距離信號傳遞和同一組織處/臨近細胞之間的短距離信號傳遞。而這兩種“交流”需要不同的、可移動的“信使分子”來完成，這種“信使分子”又可細分為激素和小肽。激素作為一種重要的生長調(diào)節(jié)因子，在植物的生長發(fā)育、環(huán)境應答等過程中扮演了不可替代的作用，研究證明，植物激素包括生長素、乙烯和細胞分裂素等均可作為長距離信號分子參與脅迫應答[5]。而關于小肽的研究則明顯滯后于激素，1991年在番茄葉片中發(fā)現(xiàn)的由18個氨基酸組成的系統(tǒng)素可以作為可移動的信號分子在葉片之間傳遞“蟲咬信號”，首次提出小肽是一種短距離運輸?shù)男盘柗肿覽6]，C-terminally encoded peptide(CEP)這種小肽被證明可由“氮饑餓”條件所誘導并運輸?shù)降厣喜浚S后另外一種小肽CEPD1從地上部將這種信號傳遞到根部，并促進了根部NO3-轉(zhuǎn)運蛋白的表達，至此，小肽被證明也可以參與長距離運輸[7]。小肽是由多個氨基酸串聯(lián)組成的一條多肽鏈，其長度暫時沒有明確的界定值，又稱寡肽，微肽或短肽[8]，目前鑒定到的最短的僅由5個氨基酸組成的Phytosulfokine(PSK)小肽[9]，較長的卻有多達120個氨基酸組成的分泌型脂質(zhì)結合多肽(cysteine-rich peptides，CRPs)等[10]。小肽和激素具有很高的相似性，因此，有學者將小肽定義為“一類未被定義的激素”。

近年來，高通量測序技術的發(fā)展與成熟，多種小肽被鑒定并被證明具有多種生物學功能，如可影響根莖分生組織發(fā)育、自交不親和、花粉管生長、氣孔形態(tài)維持和外源NO3-的吸收等多個過程[11-14]，其在脅迫應答信號傳遞中的作用愈加顯著[15-20]，外源合成的小肽可顯著提高植物對低溫、干旱、病原菌等的耐受能力[21-22]。

花生作為重要的油料和經(jīng)濟作物，花生肽的研究主要集中在多肽制備，理化性質(zhì)分析以及在食用和人類健康中的功能研究，其在環(huán)境脅迫中的應用鮮見報道[23-24]。本文系統(tǒng)概括了植物小肽在環(huán)境脅迫應答方面的最新研究成果，并對相關分子機制進行了總結，旨在為深入研究小肽在花生抗逆、抗病中的應用提供理論支持。

1 小肽在脅迫應答中的功能研究

目前關于小肽的功能研究主要集中于調(diào)控植物生長發(fā)育方面，在生物和非生物脅迫方面的功能研究報道相對較少，其在生物脅迫響應方面的功能研究主要集中在植物抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)方面。植物抗菌肽又稱多肽抗生素，是一類水溶性好、熱穩(wěn)定性強、免疫原性低、廣譜抗菌活性、半胱氨酸豐富的分泌型小肽，分子量通常在10 kDa以下[25]。目前報道的抗菌肽有150多種，根據(jù)其氨基酸的保守性和高級結構的不同可以分為硫素(thionins)、植物防御素(plant defensins)、打結素(knottins)、非特異性脂轉(zhuǎn)運蛋白(non-specific lipid transfer proteins，nsLTPs)、鳳仙花素(1bAMPs)、薺菜素(shepherdins)、蛻皮素(snakins)、橡膠素(heveins)和環(huán)肽(cyclotides)等九大類[26-27]。其抗菌機制有多種，例如植物防御素通過與真菌質(zhì)膜高親和位點結合形成離子通道，引起K+外流、Ca2+吸收、改變膜透性、實現(xiàn)對真菌的抑制[28]；受傷番茄葉片中發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng)素(Hydroxyproline-rich glycopeptide，HypSys)是含有18～20個氨基酸的小肽，它是茉莉酸信號轉(zhuǎn)導途徑中的可移動的信號分子，可通過激活防御基因的表達參與植物抗蟲免疫反應[29]；植物的激發(fā)子小肽(plant elicitor peptide，AtPep1)是擬南芥中首個報道的防御相關小肽，可通過促進防御基因plantdefensin1.2(PDF1.2)和病程相關蛋白(pathogen-related1，PR1)的表達提高植物的防衛(wèi)能力[30]；Phytosulfokine(PSK)是含有五個氨基酸的硫磺肽(Tyr-Ile-Tyr-Thr-Gln)，不僅能夠促進植物的生長和花粉管的發(fā)育[31]，還可作為免疫信號通路的負調(diào)控因子，依賴特異受體Phytosulfokine Receptor 1(PSKR1)弱化PAMP誘導的免疫反應(PAMP-triggered immunity，PTI)，防止過量免疫反應影響植物的正常生長發(fā)育[32]。

小肽除了在抗菌抗蟲免疫反應中發(fā)揮作用外，在非生物脅迫應答過程中也具有不可替代的作用。胞外分泌型小肽家族CLAVATA3/embryo surrounding region(CLE)除了在根部發(fā)育方面具有重要功能外，該家族成員CLE9還可通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)級聯(lián)途徑調(diào)控氣孔閉合，減少水分散失，從而增強擬南芥對干旱的耐受性[33]；水稻Small peptide drought tolerance 11(OsDTT11)編碼了一個長度為88個氨基酸、半胱氨酸豐富的外分泌小肽，可依賴ABA參與干旱脅迫響應，過表達OsDTT11可提高水稻的干旱抗性[34]；過量表達Drought and salt stress response-1(OsDSSR1)提高了水稻的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性糖的含量，最終提高了水稻的耐旱性[35]；除此之外，擬南芥鹽誘導的小肽cysteine-rich secretory proteins antigen 5 and pathogenesis-related 1 proteins derived peptide 1(AtCAPE1)通過抑制滲透調(diào)節(jié)和抗氧化途徑中關鍵基因的表達，適度抑制鹽脅迫應答反應，防止過度應答對植物生長造成負作用[36]。

2 小肽在脅迫應答中的應用

小肽發(fā)揮作用的分子機制是其實際應用的重要前提和理論基礎。小肽在生物脅迫中的應用主要包括“小肽轉(zhuǎn)基因方向”和“外源施加以達到增強植物抗病能力”兩個方面。大量證據(jù)表明，抗菌肽對病原菌具有廣譜抗性，如過量表達大麥硫素、胡蘿卜防御素RsAFP2、大白菜防御素BSD1及大麥轉(zhuǎn)脂蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草明顯增強了對真菌或細菌的抗性；過量表達橡膠素類多肽抗生素Ah-AMP2，同樣增強了煙草對青枯病和黑脛病的抗性[37-39]；轉(zhuǎn)基因水稻表達的燕麥硫素基因(Asthil)顯著增強了對莢殼假單孢菌(Pseudomonaspedunculata)的抗性[40]；Francois等在擬南芥中嘗試同時表達胡蘿卜防御素Rs-AFP2和大麗花防御素Dm-AMP1兩種抗菌肽，結果顯著提高了植物對黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)等真菌的抗性[41]。

人工合成抗菌肽或利用微生物進行大量發(fā)酵生產(chǎn)，從而制備特殊的抗菌生物制劑是另一個重要的研究領域。目前有多種小肽已被人工合成并被證明具有明顯的抗菌效果。Rs-AFP2是以蘿卜防御素為基礎合成的小肽，能夠抑制多種真菌的生長[21]；D32R是檀梨屬琉瑾的類似物，具有抑制致病性真菌(F.oxysporum,Plectosphaerellacucumerina，Botrytiscinerea)和致病性細菌(X.campestrispv.Translucens，C.michiganensis.)的功能[42]；RAF26是人工合成的抗真菌六肽，能夠顯著抑制Penicilliumitalicum，Penicilliumdigitatum，Botrytiscinerea等真菌的生長[43]。

植物小肽在非生物脅迫應答中的應用研究結果表明，AtPep3是一種可被鹽誘導上調(diào)的小肽，體外合成并外施其C段的13個氨基酸(KPTPSSGKGGKHN)能明顯抑制鹽脅迫誘導的葉片失綠現(xiàn)象，增強植物對高鹽的耐受性[22]；外源大豆多肽對于低溫脅迫下香蕉幼苗體內(nèi)可溶性蛋白的積累有顯著的促進作用，并能降低幼苗細胞的膜脂過氧化程度，從而提高巴西蕉的耐冷能力[44]；噴施外源大豆多肽或聚天冬氨基酸可提高巴西蕉的抗高溫和耐鹽能力，保證巴西蕉在鹽脅迫下維持較高的光合速率[45-46]。

3 花生多肽的研究進展

我國是花生生產(chǎn)大國，籽仁被大量用來生產(chǎn)食用油，其副產(chǎn)物—花生粕產(chǎn)量雖較高，但并未得到深加工利用。目前關于花生肽的研究主要集中于花生多肽制備、理化性質(zhì)分析和功能研究。對花生粕適度水解會形成花生多肽，不僅可改善其物化性質(zhì)，還可提高其吸收性和營養(yǎng)價值[47]。研究發(fā)現(xiàn)，花生肽具有顯著的體外抑菌活性[48-49]，可通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性來降低血壓[50-51]，能夠清除多種人體自由基，發(fā)揮抗氧化和延緩衰老的功能[52]。因此，尋找關鍵的功能小肽是花生蛋白深入研究的重點和熱點。

4 花生小肽在脅迫應答中的應用前景與展望

目前關于小肽基因工程和其外源功能的研究多在水稻、擬南芥和煙草等植物中開展，雖然花生耐貧瘠耐干旱性較強，但花生對環(huán)境的依賴性依然較強，尤其在鹽堿地的生長明顯受到環(huán)境脅迫的影響和抑制，使花生產(chǎn)量和質(zhì)量大幅降低。青枯病、葉斑病、白絹病、蠐螬和蚜蟲等各種病蟲害發(fā)生嚴重，也嚴重影響花生正常生長。因此，篩選既有抗菌能力又具抗逆能力的小肽，研究其對花生生長發(fā)育、抗菌、抗病等的促進作用具有重要意義。

在小肽—作物(花生)—抗病三者間的關系研究中，“優(yōu)質(zhì)抗菌肽”既可促進植物生長，還可提高花生抵抗各種細菌、真菌等生物脅迫能力，大幅減少農(nóng)藥的使用?？鼓嫘‰脑谔岣咧参锏挚垢鞣N不利生長條件的能力，降低鹽堿脅迫對花生生長的抑制有重要意義。目前如何大幅度降低成本、批量生產(chǎn)并儲存是小肽研究應用中急需攻克的關鍵因素和技術途徑，采用微生物發(fā)酵和大批量工廠合成途徑雖可行，但具體的工程優(yōu)化尚需進一步探索。

通過生物信息學、轉(zhuǎn)錄組學和小肽組學等方法尋找花生“優(yōu)質(zhì)小肽”，是目前較為迫切的問題。目前花生的兩個二倍體野生種和四倍體栽培種的基因組序列信息已經(jīng)公布，利用生物信息學和轉(zhuǎn)錄組學為切入點，結合小肽尤其是外分泌小肽的特點，尋找功能小肽，進行具體的功能驗證，以確定該小肽是“抗菌肽”還是“抗逆肽”。另外，小肽組學技術的成熟，也使得優(yōu)質(zhì)小肽的發(fā)掘工作變得簡單、有效。從植物的木質(zhì)部汁液中尋找可分泌及可被運輸?shù)姆置谛‰囊彩禽^好的研究策略，但對于花生這種莖部較短的植物來說，要收集供小肽篩選所需5 kg左右的木質(zhì)部汁液是一項較為艱巨的任務。

綜上所述，小肽領域的研究在其他物種已有很大進展，尤其在動物研究領域，如用于靶向人類癌細胞的靶分子，其實就是一種多肽分子。基于花生基因組的測序時間較晚，相對于其他物種的研究明顯滯后，但花生小肽的研究與深入，勢必在花生抵御逆境脅迫研究領域發(fā)揮重要作用。