豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測及注意事項

廖跟東 （廣西田東縣動物疫病預防控制中心 531500）

豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測是檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體水平的一種方法，是檢驗免疫效果的重要依據(jù)。檢測過程中如果不嚴格遵守操作規(guī)程檢測，將對檢測結果產(chǎn)生影響，現(xiàn)將本人多年來檢測操作及注意事項歸納如下，供大家參考。

1 樣品準備

血清稀釋板中，用樣品稀釋液按1∶1比例稀釋待檢血清、陽性和陰性對照血清 （例如∶120μl樣品稀釋液中加120μl待檢血清）。

2 洗滌液準備

將20倍濃縮洗滌液恢復至室溫 （20～25℃），搖動使沉淀溶解，然后用蒸餾水或純水作20倍稀釋，混勻 （例如10ml的濃縮洗滌液加上190ml純水）。

3 操作步驟

（1）取抗原包被板加稀釋好的洗滌液200μl，無需靜置，直接甩掉孔中洗滌液，在吸水材料上拍干，重復洗滌共計洗板2次 （如用洗板機洗滌，最后一次拍干）。

（2）將稀釋好的待檢血清、陽性和陰性對照血清各取100μl加入到抗原包被板孔中，陽性對照和陰性對照各設2孔 （輕輕振勻孔中樣品，勿溢出），用封板膜覆蓋包被板，置37℃孵育 2h。

（3）掀棄封板膜，甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200μl，無需靜置，直接甩掉孔中洗滌液，在吸水材料上拍干，重復洗滌共計洗板5次 （如用洗板機洗滌，最后一次拍干）。

（4）每孔加酶標記物100μl，用封板膜覆蓋包被板，置37℃孵育 30min。

（5）洗滌5次，方法同3.3。

（6）每孔先加底物液 A50μl，再加底物液 B50μl，輕微振動反應板混勻，室溫 （20～25℃）避光顯色1min。

（7）每孔加終止液50μl，輕微振動反應板混勻。

（8）設置酶標儀測量波長為630nm，10min內(nèi)測定各孔OD630nm值。

4 結果判定

試驗成立條件是陰性對照的平均OD630nm＞0.5，陽性對照的阻斷率均＞50%。如果試驗不成立有可能是實驗操作失誤造成，再操作一次。S為樣品OD630nm值，N為陰性對照平均OD630nm值。

阻斷率=（1-S/N）×100%。如果阻斷率≤30%判為陰性，如果阻斷率≥40%判為陽性，阻斷率在30～40%，該樣品判為可疑。

5 檢測中應注意事項

（1）在抗原包被板設陰、陽性對照各2孔，每孔的陰、陽血清稀釋來源于同一個稀釋孔稀釋 （即一次稀釋總量為240μl，移液器吹勻后分兩次吸取，每次取100μl加到抗原包被板孔）。

（2）實驗過程使用一次性槍頭移液器標準操作 （吸液時摁到第一擋位，棄液時摁到第二擋位），使用多孔道移液器時，觀察每孔道的吸液量是否一致，如不一致，要壓緊吸頭。

（3）試劑盒保存溫度為2～8C，避免緊貼冰箱壁，造成試劑結冰。未用完的反應板應密封保存在密封袋里，2～8℃保存。

（4）所有試劑用前應恢復至室溫 （20～25℃），回溫至少20min。加底物前確保底物液A、B在室溫 （20～25℃），回溫至少30min，且不能將A、B液混合后加入反應孔，否則結果不準確。

（5）在37℃恒溫箱孵育時，說明書上沒有對反應板作任何要求的不能對反應板貼膜或加蓋子、濕毛巾等，否則結果不準確。

（6）不同批次試劑盒組分不能混用，尤其是反應板，對照及酶標抗體，避免影響實驗結果。

（7）待檢血清樣品數(shù)量較多時，應先使用血清稀釋板稀釋完所有待檢血清，再將稀釋好的血清轉移到抗原包被板上，使反應時間一致。

（8）實驗時，環(huán)境溫度控制在20～25℃，實驗過程不要將反應板直接放在冰冷的臺面上。否則結果不準確。

（9）如出現(xiàn)連續(xù)多次或多人實驗檢測結果異常時，應更換酶標儀測定，驗證原酶標儀是否可能出現(xiàn)故障。