食源性致病菌的檢測技術(shù)研究進展

蘇粉良，李冰燕，陳雨欣，周 雯

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州 215006；2.蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇蘇州 215004）

0 引言

食品安全是全世界共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，由細菌導(dǎo)致的食物中毒的數(shù)量占各種食物中毒之首，食源性疾病已經(jīng)成為危害食品安全最主要的原因之一[1-2]。常見的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌、出血性大腸桿菌O157∶H7、空腸彎曲菌、阪崎克羅諾桿菌等。這些致病菌在食品中存活、生長代謝引起食品變質(zhì)，同時有些致病菌分泌有毒物質(zhì)，直接或間接導(dǎo)致患病。因此，應(yīng)用準確有效的檢測技術(shù)來控制食源性疾病的流行具有非常重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

1 食源性致病菌的檢測方法

1.1 傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)技術(shù)

作為食品微生物檢測的“金標(biāo)準”，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)技術(shù)在食源性致病菌檢測方面具有舉足輕重的作用。目前，食品安全國家標(biāo)準里均有致病菌傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定技術(shù)要求。其基本原理為稱取一定數(shù)量的待檢樣品，通過（選擇性）增菌液富集培養(yǎng)，后劃線分離到選擇性培養(yǎng)基，觀察菌落形態(tài)。挑取典型菌落染色鏡檢、做后續(xù)的生化鑒定和血清學(xué)分型。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，靈敏度高、特異性強顯色培養(yǎng)基投入到檢測過程，有效提高了篩選效率。在后續(xù)的生化鑒定過程中，全自動微生物鑒定分析系統(tǒng)的使用可以簡化試驗步驟、縮短試驗周期，并且能更高效地得出試驗結(jié)果。

但是，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)技術(shù)試驗周期比較長、步驟比較繁瑣，在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中該技術(shù)無法做到高通量快速檢測，不能起到有效的監(jiān)測、預(yù)防作用，并且在試驗結(jié)果的判定方面對檢測人員的要求比較高。此外，對于一些在食品加工過程中受損的致病菌（活的不可培養(yǎng)狀態(tài)）、持留菌、休眠菌及代謝異質(zhì)菌來說，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)技術(shù)還是存在一定的缺陷，會導(dǎo)致這種類型致病菌的漏檢[3]。

1.2 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)技術(shù)是指抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合會產(chǎn)生相應(yīng)的信號，通過監(jiān)測該信號來判斷待檢樣本中是否有目標(biāo)物質(zhì)。

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗應(yīng)用了抗原抗體之間特異性反應(yīng)的原理，在檢測過程中通過酶標(biāo)抗體（抗原）催化底物顯色來對待檢樣品進行定性或定量分析。多名專家應(yīng)用該方法對不同的細菌進行試驗研究，結(jié)果表明酶聯(lián)免疫吸附試驗?zāi)茉?4 h內(nèi)檢測多種食源性致病菌。例如，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附原理制造的mini-Vidas全自動免疫分析儀可在1～2 d內(nèi)快速篩檢沙門氏菌、大腸埃希氏菌、單核細胞增生李斯特菌和空腸彎曲菌等[4]。

1.2.2 免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)以固定有檢測限和控制限的條狀纖維層材料為固定相，測試液為流動相，由于毛細管作用原理，樣品溶液在層析條上泳動，當(dāng)樣品移動到包埋有抗體的地方時，樣品中相應(yīng)的抗原就會與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合發(fā)生免疫反應(yīng)，通過酶反應(yīng)或者是直接運用可目測的標(biāo)記物（如膠體金、彩色乳膠等）得到試驗結(jié)果。免疫層析技術(shù)包括膠體金免疫層析技術(shù)、碳納米顆粒免疫層析技術(shù)、熒光微球免疫層析技術(shù)和量子點免疫層析技術(shù)[5]。其中，膠體金免疫層析技術(shù)是在20世紀80年代初發(fā)展起來的，具有快速、簡單、低價、適應(yīng)性廣等優(yōu)點[6]，適合基層單位進行各種食源性致病菌的快速篩查。國內(nèi)外不少人研制膠體金試紙條，并用于食源性致病菌的檢測[6]。黃嶺芳等人[7]用該方法檢測食品中的大腸桿菌O157，最低檢測限為1×104CFU/mL。

1.2.3 免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)是將特定致病菌的抗體偶聯(lián)到磁珠微球上并通過抗原抗體反應(yīng)形成磁珠，通過外部磁場磁力的作用，將目標(biāo)致病菌分離出來的技術(shù)。目前，免疫磁珠分離技術(shù)可以與多種技術(shù)聯(lián)合使用來實現(xiàn)對食源性致病菌的快速檢測[8]。比如，結(jié)合顯色培養(yǎng)基分離技術(shù)、PCR技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)、流式細胞儀分析等，這樣不僅可以節(jié)省檢測時間，還可以對樣品進行高通量篩檢。隨著免疫磁珠分離技術(shù)的不斷發(fā)展，目前研發(fā)人員已經(jīng)建立了一些不需要擴增培養(yǎng)就可以檢測目標(biāo)菌的技術(shù)方法，時間可以控制在3 h以內(nèi)，從而真正地實現(xiàn)了致病菌快速檢測[9-11]。

1.2.4 其他免疫學(xué)技術(shù)

除以上3種免疫學(xué)檢測技術(shù)以外，免疫擴散技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、乳膠凝集法等都在食源性致病菌檢測中有所應(yīng)用[12]。

免疫學(xué)技術(shù)具有特異性好、效率高、檢測成本低、不需要大型儀器等優(yōu)點，但是當(dāng)待檢食品中含有目標(biāo)菌的競爭性物質(zhì)時則很有可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，靈敏度不高，這些因素限制了免疫學(xué)技術(shù)在食源性致病菌檢測中的廣泛應(yīng)用。

1.3 分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，為食源性致病菌生物快檢工作提供了良好的技術(shù)平臺。

1.3.1 聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（PCR技術(shù)）

PCR技術(shù)檢測食源性致病菌是指將目標(biāo)菌DNA為模板，先經(jīng)高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計的2條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補序列發(fā)生退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的作用下以4種脫氧核糖核酸（dNTP） 為底物，使退火引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán)，使目標(biāo)菌的DNA擴增，然后通過電泳檢測PCR產(chǎn)物是否有特征條帶，從而實現(xiàn)為目標(biāo)菌的快速檢測。近年來，用PCR技術(shù)在食源性致病菌領(lǐng)域發(fā)展很好，檢測方法也多樣化，如普通PCR、實時熒光定量PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR和電化學(xué)發(fā)光PCR[13]等，也可將幾種方法結(jié)合使用[12]。目前，國內(nèi)有很多PCR方法已經(jīng)變成檢測標(biāo)準，以出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準為多。

1.3.2 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是由生命科學(xué)與微電子學(xué)等學(xué)科相互交叉發(fā)展起來的一門高新技術(shù)，生物芯片直接檢測致病菌的DNA，可以解決復(fù)雜樣品中存在酶抑制物的問題，與傳統(tǒng)的生物檢測技術(shù)相比具有信息量大、處理快速、所需樣品少、污染少等優(yōu)點[14]。目前，生物芯片技術(shù)應(yīng)用最成功的是基因芯片。

應(yīng)用基因芯片檢測致病菌原理是基于細菌的16S rRNA基因的高度保守性。由于16S rRNA基因的長度最合適，是目前最常被選用作細菌的分類和鑒定的基因[15]。李君文等人[16]曾經(jīng)用基因芯片檢測水中常見的致病菌，并可對水中致病菌實行高通量檢測，通過一次試驗可以得出全部結(jié)果。

1.3.3 DNA探針技術(shù)

DNA探針是經(jīng)過某種標(biāo)記物（放射性同位素、酶、熒光素、化學(xué)發(fā)光物、鑭系元素等） 標(biāo)記過的單鏈DNA[17]，它在體外合適的條件下按照堿基互補配對的原則，與靶DNA形成雜交DNA分子，通過檢測雜交信號來判斷樣品中是否含有待測致病菌。通常選擇待測致病菌的特異性保守基因序列為目標(biāo)DNA，并以其互補DNA序列為雜交探針。DNA探針的特異性，保證了檢測結(jié)果的高度特異性[18]。

分子生物學(xué)技術(shù)特異性強、靈敏度高、操作簡單快速等優(yōu)點逐漸被人接受，但是不可忽視的是該技術(shù)容易出現(xiàn)假陽性和假陰性，而且儀器和試劑耗材費用較大，另外操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)上崗等因素限制了其廣泛應(yīng)用。

1.4 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器技術(shù)是一種由生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)、電子技術(shù)等多種學(xué)科互相滲透形成起來的高新微量分析技術(shù)生物。生物傳感器主要由生物分子識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件2個部分組成，其基本原理為:當(dāng)待測物與分子識別元件特異性結(jié)合后，所產(chǎn)生的復(fù)合物（或光、熱等）通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘枴⒐庑盘柕?，從而達到分析檢測的目的[19]。通過生物傳感器技術(shù)，能夠檢測出食品中低濃度病原菌，并且適合對食品進行實時監(jiān)測[20]。該技術(shù)已經(jīng)被用到食源性致病菌的檢測工作當(dāng)中。Luo Jinping等人[21]曾用生物傳感技術(shù)來檢測牛肉汁中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌；2002年，Tahir Z M等人[22]采用電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)在10 min內(nèi)完成大腸桿菌O157∶H7的檢測分析，并且精度達到10 CFU/mL；2014年，葉雪梅等人[23]用生物傳感器檢測食品中的沙門氏菌，并做了傳感器持久性的研究。武會娟等人[24]采用免疫生物傳感器檢測食品中的單增李斯特菌，花費時間4.5 h，檢出濃度達100 CFU/孔。

生物傳感器的好處是需要的檢測樣本量少、檢測結(jié)果靈敏度高、重復(fù)性好。但是目前仍處于研究階段，且檢測費用高，不利于推廣[25]。

1.5 代謝學(xué)檢測技術(shù)

代謝學(xué)檢測技術(shù)的原理是在培養(yǎng)基中繁殖食品微生物，通過研究其在代謝過程中產(chǎn)生的特異物質(zhì)、分子等變化特征，間接獲取食品微生物量化結(jié)果。代謝學(xué)檢測技術(shù)包括三磷酸腺苷（ATP） 生物發(fā)光法、電阻抗技術(shù)、微量生化法。

1.5.1 ATP生物發(fā)光法

ATP是細胞內(nèi)必需的一種代謝產(chǎn)物，在一定條件下細胞內(nèi)ATP含量比較穩(wěn)定，因此通過測定細菌的ATP含量可間接計算出樣品中的活菌數(shù)。該法常用來檢測活細菌總數(shù)，反映食品受污染的嚴重程度，具有簡便、省時、快速等特點，還可以被用于大量食品樣本中菌污染情況檢測和食品現(xiàn)場快速檢測等。但是，若樣品中含有大量非細胞性ATP，則檢測結(jié)果可受干擾[26]。

1.5.2 電阻抗技術(shù)

電阻抗技術(shù)是根據(jù)微生物在培養(yǎng)基中代謝活動的不同，通過電阻抗測量法對微生物進行鑒定的技術(shù)。工作原理為：細菌在生長繁殖過程中，會把培養(yǎng)基中的大分子物質(zhì)，如碳水化合物和蛋白質(zhì)等代謝為小分子的乳酸鹽和氨基酸等，培養(yǎng)基的導(dǎo)電性就會隨之發(fā)生變化，因此可以通過檢測培養(yǎng)基導(dǎo)電性的變化情況來判斷細菌在培養(yǎng)基中的繁殖特性[27]。目前，電阻抗法已被AOAC接收，適用于檢測食品中的病原體，目前可用于食品中細菌總數(shù)、大腸桿菌和沙門氏菌等的檢測，該方法較常規(guī)方法敏感、快速，而且特異性高、重復(fù)性好[28]。

1.5.3 微量生化法

微量生化法包含微熱量技法、放射測量法等。微熱量技法是指通過測定細菌生長代謝時的熱效應(yīng)來檢測細菌，可以通過熱量變化來鑒別菌種；放射測量法原理是細菌在生長繁殖過程中代謝含14C標(biāo)記的碳水化合物進行并釋放出含有放射性的14CO2，然后通過測定放射性的14CO2含量而測定食源性致病菌。Previte J J[29]曾經(jīng)應(yīng)用放射測量技術(shù)來檢測食品中微生物，由于該方法應(yīng)用到了放射性物質(zhì)，在應(yīng)用上有很大的限制。

1.5.4 基于氣味指紋技術(shù)的電子鼻方法

微生物在代謝過程中會產(chǎn)生特定的代謝產(chǎn)物，不同的微生物，其產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物往往不同。但是，它們一般具有種屬特征，因此可以根據(jù)這些氣味物質(zhì)和由它們組成的氣味指紋圖譜來進行不同微生物的鑒定與檢測。由于該方法主要是針對微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，因此對樣品沒有什么特殊的要求。除了檢測迅速、靈敏度高外，該法最主要的優(yōu)點是無需對樣品進行任何處理,因此在微生物無損檢測方面具有很好的應(yīng)用前景[30]。

1.6 其他檢測技術(shù)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，先進儀器的使用也為食源性致病菌檢測提供了良好的技術(shù)平臺。其中基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）是最近發(fā)展起來的一種鑒定食源性致病菌的儀器。目前，已有許多應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)進行食源性致病菌鑒定的相關(guān)報道。有人曾應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)成功鑒定區(qū)分了金黃色葡萄球菌、致瀉性大腸埃希氏菌、志賀氏菌、黏質(zhì)沙雷氏菌、腸炎耶爾森氏菌、芽孢桿菌屬等31株常見食源性致病菌。

流式細胞術(shù)是能夠用來快速檢測液相中懸浮粒子多種物理特性的一種現(xiàn)代分析方法。因其具有分析速度快和靈敏度高等優(yōu)點，該方法正逐漸被應(yīng)用于食源致病菌的檢測。但是該方法使用的試劑成本高、人員技術(shù)難度大、受檢樣品局限，難以普及推廣，因此目前只適用于科研和醫(yī)療機構(gòu)[31]。

2 結(jié)語

食源性致病菌檢測是食品安全的一個重要方面，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，食源性致病菌檢測技術(shù)也在不斷地出現(xiàn)。在實際的食品檢測過程中，使用最為廣泛的還是傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定技術(shù)，同時也會使用一些快速檢測手段，如VITEK，mini-vidas等儀器或生化鑒定試劑條等輔助檢測。快速檢測手段可以用于突發(fā)的公共衛(wèi)生事件或者是批量化篩檢。在快速檢測技術(shù)中，分子生物學(xué)技術(shù)中的PCR技術(shù)是目前研究的最深入、最成熟的檢測技術(shù)，應(yīng)用得也較為廣泛，該方法已經(jīng)有相應(yīng)的國標(biāo)[32]。免疫學(xué)技術(shù)主要以試劑盒或是試紙條等產(chǎn)品的方式應(yīng)用于檢測工作，但是由于其靈敏度不高等缺點沒有得到廣泛的應(yīng)用。其他一些快速檢測技術(shù)仍處于試驗研究階段，并未得到推廣應(yīng)用。綜合來看，每種檢測技術(shù)都有其自身的缺陷，但是隨著多種學(xué)科的共同發(fā)展，多種檢測技術(shù)聯(lián)合使用將會大大提高檢測的準確性，縮短檢測時間，在食源性疾病的預(yù)防和控制的方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

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