姜辣素的酶法提取及其對亞硝酸鹽清除的研究

孫昕，蘇平，魏丹

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

由于亞硝酸鹽的發(fā)色和抑菌作用，肉類制品中允許其作為發(fā)色劑限量使用。但亞硝酸鹽會對人體產(chǎn)生毒性，其中主要原因是它可以使血紅蛋白的亞鐵離子氧化成鐵離子，從而引起高鐵血紅蛋白癥，導(dǎo)致人體組織攜氧能力受損[1]。此外，亞硝酸鹽還會與肉中蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的胺類物質(zhì)發(fā)生亞硝化反應(yīng)，生成亞硝胺類物質(zhì)，具有強(qiáng)致癌性[2]。

生姜（Zingiber officinale Roscoe）的主要成分可大致分為兩類：姜油樹脂和揮發(fā)油，是中國人熟知且日常使用率極高的一種香辛料。生姜具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、止痛等多種藥理作用，普遍認(rèn)為生姜中的活性物質(zhì)是非揮發(fā)性的辛辣味成分，即姜酚、姜烯酚、姜酮酚、姜油酮等，統(tǒng)稱為姜辣素[3-5]。

目前姜辣素的提取方法主要有有機(jī)溶劑提取法、超聲波輔助提取法、酶法輔助提取法、超臨界萃取法等[6-8]。酶解法不僅可以溶解和軟化生姜的細(xì)胞壁，還會破壞細(xì)胞壁的主要成分，即纖維素的β-1，4-糖苷鍵，使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，生姜中的有效成分會更多的溶解出來。有研究表明酶解法能提高姜油樹脂得率、6-姜酚以及總多酚的提取率[9]。超聲輔助提取法可以使得分子移動和溶劑滲透加快，進(jìn)而提高姜辣素的提取率。因此，目前已有將纖維素酶酶解法與超聲輔助及微波輔助提取相結(jié)合的研究[10-11]。但是超聲輔助提取可能會使提取物中的某些活性成分發(fā)生降解、聚合、氧化等多種反應(yīng)[12-13]，進(jìn)而影響所提取的姜辣素的活性。所以獲得提取率和活性都較高的姜辣素的提取方法仍值得研究。

有研究表明生姜微波水提液經(jīng)提取工藝優(yōu)化后對亞硝酸鹽的清除率為30.14%[14]。陳冬麗[15]等研究了在模擬胃液（pH=3.0，溫度37℃）的條件下南姜水提液對亞硝酸鹽的清除作用，研究發(fā)現(xiàn)2 mL的水取液對亞硝酸鹽的清除率最大，其清除率為53.12%。而將經(jīng)酶解法輔助提取的姜辣素粗提物用于清除亞硝酸鹽和優(yōu)化其反應(yīng)條件的研究還未見報道。因此，本試驗以生姜為原料，采用纖維素酶法輔助乙醇提取姜辣素類物質(zhì)，研究其最佳提取工藝，并將提取的物質(zhì)用于清除亞硝酸鹽的研究，以期為為開發(fā)天然有效的亞硝酸鹽清除劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜品種為山東大姜，產(chǎn)自浙江嘉興嘉善，經(jīng)60℃鼓風(fēng)干燥10 h，含水量為11%，使用前將生姜粉碎過100目篩備用。

纖維素酶（10 000 U/g）、香草醛標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99%）：阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PH070A恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；TGL20M高速冷凍離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；SHJ-6AB磁力攪拌水浴鍋：金壇市良友儀器有限公司；UV-2550分光光度計：日本島津公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；195（A65412906）真空冷凍干燥機(jī)：美國LABCONCO公司。

1.3 方法

1.3.1 姜辣素的提取及其提取率的測定

采用纖維素酶酶解法輔助乙醇提取姜辣素，參照唐仕榮[6]等的方法測定姜辣素的提取率。將粉碎過篩的生姜粉加入到一定量溶解在蒸餾水中的纖維素酶溶液，在一定溫度下提取一段時間，在50℃的條件下經(jīng)無水乙醇萃取及沉淀后經(jīng)4 000 r/min離心15 min。取3.5 mL上清液用乙醇定容于10 mL比色管中，搖勻后測定其在280 nm處的吸光值，按式（1）計算生姜中姜辣素的提取率：

式中：T為姜辣素提取率，%；C為測定樣品吸光值對應(yīng)的香草醛濃度，μg/mL；N為提取液的稀釋倍數(shù)；M為稱取的生姜粉末質(zhì)量，g；V為樣品液的總體積，mL；2.003為香草醛換算成姜辣素的系數(shù)。

1.3.2 酶解法輔助提取姜辣素的最佳工藝條件優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗

稱取適量粉碎干燥的生姜粉末，通過改變酶解時間（30、60、90、120、150 min）、酶解溫度（30、35、40、45、50℃）、纖維素酶的添加量（0.60%、0.95%、1.30%、1.65%、2.00%）以及料液比（1∶20、1 ∶35、1 ∶50、1 ∶65、1∶80 g/mL）進(jìn)行單因素試驗，以姜辣素提取率為指標(biāo)，考察上述不同因素對姜辣素提取率的影響。

1.3.2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，設(shè)計四因素三水平的正交試驗，因素水平設(shè)計見表1，對纖維素酶酶解法提取進(jìn)行優(yōu)化。

表1 酶解法提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design of cellulase-assisted extraction

1.3.3 有機(jī)溶劑浸提法

提取方法參考張魯明[16]等文獻(xiàn)的報道，將一定質(zhì)量的生姜粉置于80%的乙醇中，料液比為1∶10（g/mL），置于50℃的恒溫水浴鍋中，期間不斷攪拌，提取2 h。

1.3.4 姜辣素粗提物的提取及制備

按1.3.1的方法得到姜辣素提取液。將上清液于50℃進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醇。取剩余的少量溶液置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得到姜辣素粗提物粉末。

1.3.5 姜辣素粗提物清除亞硝酸鹽的最佳反應(yīng)條件優(yōu)化

1.3.5.1 單因素試驗

通過改變反應(yīng)體系溫度（20、40、60、80、100 ℃）、姜辣素粗提物添加量（1、2、3、4、5 mL）、姜辣素粗提物質(zhì)量濃度（7.5、10.0、12.5、15、17.5 mg/mL）、反應(yīng)時間（10、15、20、25、30 min）進(jìn)行單因素試驗，以亞硝酸鹽清除率為指標(biāo)，考察上述不同因素對亞硝酸鹽清除率的影響。

1.3.5.2 正交試驗

根據(jù)上述單因素試驗對亞硝酸鹽清除的結(jié)果，設(shè)計三因素三水平的正交試驗，因素水平設(shè)計見表2，對亞硝酸鹽清除的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

表2 姜辣素粗提物清除亞硝酸鹽正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design of reaction conditions for nitrite scavenging by crude extracts of gingerols

1.3.6 亞硝酸鹽清除率的測定

參考盛瑋[17]等的方法并略作修改。取10 mL比色管，分別加入一定體積用無水乙醇配成一定濃度的姜辣素溶液，再加入5 μg/mL的NaNO2溶液2.0 mL，在不同溫度下反應(yīng)一定時間，立即加入0.4%對氨基苯磺酸2.0 mL，混勻，靜置5 min后，各加入1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，靜置15 min，加水至刻度混勻，在波長538 nm條件下測定吸光度A1，同時以蒸餾水代替NaNO2溶液作為空白對照試驗測定吸光度A01，以無水乙醇代替姜辣素溶液的空白對照試驗測定吸光度A02。姜辣素粗提物對亞硝酸鹽的清除率按式（2）計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解法提取姜辣素的單因素試驗

2.1.1 酶解時間對姜辣素提取率的影響

酶解時間對姜辣素提取率的影響見圖1。

圖1 酶解時間對生姜中姜辣素提取率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction yield of gingerols from ginger

由圖 1可以看出，料液比為 1∶65（g/mL）、纖維素酶添加量為2%、酶解溫度為45℃，當(dāng)酶解時間在30 min～60 min范圍時，姜辣素提取率隨著酶解時間的延長而緩慢增加，當(dāng)酶解時間在60 min～90 min范圍時，提取率明顯增加。當(dāng)酶解時間大于90 min時，提取率反而下降?？赡艿脑蚴请S著時間的延長，纖維素酶的活力逐漸提高，酶解反應(yīng)也充分發(fā)揮了作用，導(dǎo)致姜辣素不斷地從生姜中釋放。但酶解時間延長到一定時間后，有效成分已經(jīng)基本溶出，隨著酶解時間繼續(xù)增加，提取率反而會下降。說明酶解時間過長不利于提高姜辣素的提取率，還會增加熱能的消耗和時間的浪費[8]。因此，選擇最適合的酶解時間為90 min。

2.1.2 酶解溫度對姜辣素提取率的影響

酶解溫度對姜辣素提取率的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對生姜中姜辣素提取率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction yield of gingerols from ginger

由圖2可知，當(dāng)酶解溫度在30℃～45℃之間，姜辣素提取率隨著溫度的升高而增大。當(dāng)溫度超過45℃時，姜辣素提取率有所下降。這是因為隨著溫度升高，分子運(yùn)動速度不斷加快，滲透擴(kuò)散，溶解速度加快[18]。同時溫度可引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化，使姜辣素由生姜的細(xì)胞中擴(kuò)散到溶液中。但是溫度過高可引起蛋白質(zhì)變性，使得纖維素酶活性降低，導(dǎo)致其對姜辣素的提取率降低[19]。因此，纖維素酶酶解提取生姜中姜辣素的最佳溫度選擇45℃。

2.1.3 纖維素酶添加量對姜辣素提取率的影響

纖維素酶添加量對姜辣素提取率的影響見圖3。

圖3 纖維素酶添加量對生姜中姜辣素提取率的影響Fig.3 Effect of cellulose dosage on the extraction yield of gingerols from ginger

由圖3可知，當(dāng)纖維素酶用量為1.30%時，姜辣素提取率最高。纖維素酶添加量低1.30%時，隨著纖維素酶添加量的增加，姜辣素提取率也隨之增加。這是因為酶添加量低時，酶解反應(yīng)進(jìn)行得不夠完全；達(dá)到最佳值時，酶解反應(yīng)進(jìn)行得比較完全，提取率也達(dá)到最高。當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加，由于底物濃度對酶達(dá)到飽和，導(dǎo)致纖維素酶降解細(xì)胞壁的作用受到抑制，所以姜辣素提取率下降[18]。

2.1.4 料液比對姜辣素提取率的影響

當(dāng)纖維素酶添加量為1.3%、酶解溫度45℃、酶解90 min，料液比對生姜中姜辣素提取率的影響如圖4所示。

圖4 料液比對生姜中姜辣素提取率的影響Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on the extraction yield of gingerols from ginger

當(dāng)溶劑用量不斷增大時，姜辣素提取率不斷增加。當(dāng)料液比達(dá)到1∶50（g/mL）時，幾乎達(dá)到飽和狀態(tài)，再增大溶劑用量，姜辣素提取率反而會有少量下降。過多的溶劑使用不僅可以阻礙提取，還會吸收熱量，增大后續(xù)濃縮等工藝的難度[20-21]。因此，選擇1∶50（g/mL）為最佳料液比。

2.2 酶解法提取姜辣素的正交試驗結(jié)果

纖維素酶解提取姜辣素的正交試驗結(jié)果及方差分析結(jié)果見表3與表4。

表3 姜辣素最佳提取工藝優(yōu)化的正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for optimization of crude extracts of gingerols

表4 姜辣素提取正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance of the orthogonal array design for optimization of gingerols extraction

由表3可知，極差值的大小反應(yīng)了各因素對姜辣素提取率的影響，料液比（D）對姜辣素提取率的影響最大，其次是酶解時間（A），纖維素酶添加量（C），最后是酶解溫度（B）。由表2.3的方差分析可知，上述因素中料液比和酶解時間對姜辣素提取率的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），纖維素酶添加量和酶解溫度對姜辣素提取率的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

2.3 提取方法的比較

纖維素酶解法與有機(jī)溶劑浸提法比較結(jié)果見表5。

表5 纖維素酶解法與有機(jī)溶劑浸提法比較結(jié)果Table 5 Comparative extraction rate of gingerols by celluloseassisted extraction and conventional solvent extraction

在最佳提取工藝A2B3C1D2，即酶解時間90 min、酶解溫度為50℃、添加0.95%纖維素酶、料液比為1∶50（g/mL）下對進(jìn)行酶解提取，重復(fù)3次，提取率分別為1.85%、1.85%、1.84%，平均提取率為1.85%，纖維素酶法得到的提取液中的姜辣素提取率比普通乙醇溶劑浸提法均提高了28%。纖維素酶酶解法明顯優(yōu)于乙醇浸提法（P＜0.05）。

2.4 不同反應(yīng)條件對姜辣素粗提物清除亞硝酸鹽的影響

2.4.1 反應(yīng)體系溫度對亞硝酸鹽清除率的影響

12.5 mg/mL的凍干姜辣素粗提物在添加量1 mL、反應(yīng)時間15 min的條件下，反應(yīng)體系的溫度對亞硝酸鹽的清除力的影響見圖5。

圖5 不同反應(yīng)溫度對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on the scavenging rate of nitrite

隨著反應(yīng)溫度的升高，姜辣素粗提物對亞硝酸鹽清除率逐漸增加，這說明反應(yīng)溫度的提高有助于其快速捕捉亞硝酸根離子提高清除率。當(dāng)反應(yīng)溫度超過60℃時，亞硝酸鹽清除率明顯上升，當(dāng)溫度到達(dá)100℃時亞硝酸鹽清除率最高可達(dá)25.34%。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是姜辣素中的某些活性成分在高于60℃的條件下會發(fā)生一定的變化生成清除能力更強(qiáng)的物質(zhì)[22]。

2.4.2 姜辣素粗提物添加量對亞硝酸鹽清除率的影響

在反應(yīng)體系溫度為100℃、反應(yīng)時間為15 min，不同添加量對凍干姜辣素粗提物對亞硝酸鹽清除能力的影響見圖6。

圖6 不同姜辣素粗提物添加量對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.6 Effect of different dosage of gingerols on the scavenging rate of nitrite

亞硝酸鹽的清除率隨著姜辣素粗提物添加量的增加而逐漸增大，說明在一定時間內(nèi)可以通過增加姜辣素添加量的方式來提高其對亞硝酸鹽的清除效果。當(dāng)添加量為4 mL時對亞硝酸鹽的清除率基本達(dá)到最高，為85.89%。當(dāng)添加量超過4 mL時，亞硝酸鹽清除率增加緩慢，這一研究結(jié)果與李佩艷[23]等對牡丹葉黃酮提取液添加量的結(jié)果一致。因此姜辣素粗提物的最優(yōu)添加量選用4 mL。

2.4.3 姜辣素粗提物質(zhì)量濃度對亞硝酸鹽清除率的影響

在反應(yīng)體系溫度為100℃、反應(yīng)時間為15 min，添加4 mL不同質(zhì)量濃度的凍干姜辣素粗提物對亞硝酸鹽清除能力的影響見圖7。

圖7 不同姜辣素粗提物質(zhì)量濃度對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.7 Effect of gingerols concentration on the scavenging rate of nitrite

姜辣素粗提物對亞硝酸鹽的清除能力隨著質(zhì)量濃度的逐漸增加而增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/mL之后，清除率增長開始減慢。說明在一定的反應(yīng)時間內(nèi)，可以通過增加姜辣素粗提物質(zhì)量濃度的方式來提高其對亞硝酸的清除作用[24]。

2.4.4 反應(yīng)時間對亞硝酸鹽清除率的影響

在反應(yīng)體系溫度為100℃，添加4 mL質(zhì)量濃度為15 mg/mL姜油樹脂的條件下，不同反應(yīng)時間對亞硝酸鹽清除能力的影響見圖8。

圖8 不同反應(yīng)時間對亞硝酸鹽清除率的影響Fig.8 Effect of reaction time on the scavenging rate of nitrite

由圖8可知，姜油樹脂對亞硝酸鹽的清除速度較快，在反應(yīng)15 min時對亞硝酸鹽的清除作用已經(jīng)基本完全。延長反應(yīng)時間不能提高亞硝酸鹽清除率，反而會使得清除率有所下降[23]。

2.5 姜辣素粗提物清除亞硝酸鹽的正交試驗結(jié)果

纖維素酶解提取姜辣素的正交試驗結(jié)果及方差分析結(jié)果見表6及表7。

表6 姜辣素粗提物清除亞硝酸鹽的正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Orthogonal array design with experimental results for nitrite scavenging by crude extracts of gingerols

續(xù)表6 姜辣素粗提物清除亞硝酸鹽的正交試驗設(shè)計與結(jié)果Continue table 6 Orthogonal array design with experimental results for nitrite scavenging by crude extracts of gingerols

表7 姜辣素粗提物清除亞硝酸鹽的正交試驗方差分析Table 7 Analysis of variance for optimization of reaction conditions for nitrite scavenging

由表6可知，極差值的大小反應(yīng)了各因素對姜辣素粗提物清除亞硝酸鹽的影響，反應(yīng)溫度（A）對亞硝酸鹽清除率的影響最大，其次是姜辣素粗提物的質(zhì)量濃度（B），最后是反應(yīng)時間（C）。由方差分析結(jié)果可知，反應(yīng)溫度對亞硝酸鹽清除率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），姜辣素提取物質(zhì)量濃度對亞硝酸鹽清除率的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），而反應(yīng)時間的影響不顯著，這與表6中的極差分析結(jié)果相符。

在最佳的反應(yīng)條件A3B3C2，即添加質(zhì)量濃度為17.5 mg/mL的姜辣素粗提物與亞硝酸鹽在100℃下反應(yīng)15 min測定其對亞硝酸鹽的清除率分別為99.56%、99.02%、99.38%，平均的亞硝酸鹽清除率為（99.32±0.22）%。添加1 mg/mL的抗壞血酸溶液對亞硝酸鹽的清除率可達(dá)（99.74±0.13）%，而達(dá)到相同效果需要的姜辣素粗提物的量則多于所需的抗壞血酸的量。

3 結(jié)論

生姜具有多種生理活性，而其中的主要活性物質(zhì)為姜辣素，采用纖維素酶法輔助乙醇提取其中的姜辣素，通過單因素試驗和正交試驗得到最佳提取工藝：纖維素酶酶解時間為90 min、酶解溫度為50℃、添加0.95%纖維素酶、料液比為 1 ∶50（g/mL），在此條件下生姜中的姜辣素的平均提取率為1.85%，高于乙醇浸提法，也高于楊毅等[25]采用纖維素酶與半纖維素酶法聯(lián)合提取的提取率，僅比李小龍等[26]采用纖維素酶法結(jié)合超聲提取的提取率低6.57%。但本試驗的操作溫度較低，可較好的保證姜辣素粗提物的原有活性。且與以往關(guān)于纖維素酶輔助提取姜辣素的研究的不同之處在于本試驗固定了生姜粉的添加量不變，通過改變?nèi)軇┑挠昧窟_(dá)到改變料液比的目的，可以降低由于溶劑不足而使得姜辣素等有效物質(zhì)難以溶出所導(dǎo)致的提取率降低的不利影響[10，25-26]。

生姜中的姜辣素粗提物具有明顯的清除亞硝酸鹽的作用，通過對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后得到清除亞硝酸鹽的最優(yōu)反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度100℃、4 mL質(zhì)量濃度為17.5 mg/mL姜辣素粗提物、反應(yīng)時間15 min，在最優(yōu)條件下其對亞硝酸鹽的清除率可達(dá)99.32%，與1 mg/mL同體積的抗壞血酸溶液對亞硝酸鹽的清除能力相當(dāng)。

生姜中的姜辣素粗提物能有效地清除亞硝酸鹽，可能具有一定的防癌作用。我國生姜資源豐富，采用纖維素酶酶解法從生姜中提取姜辣素類物質(zhì)并將其用于亞硝酸清除的研究，具有操作簡便、安全性高的特點。因此具有廣闊的應(yīng)用前景，值得研究人員們更加深入地研究。

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