急性缺血性卒中患者血清胱抑素表達水平及結(jié)構(gòu)形式的臨床研究

馬金花，馬斌武，梁雪云

胱抑素C(Cys C)參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程，其損傷對神經(jīng)細胞凋亡的影響及其機制還不是很清楚。本文研究急性腦缺血后患者血清Cys C表達水平是否會升高，升高是否以寡聚體升高為主，是否與急性腦缺血的嚴重程度有關，為下一步在細胞層面研究不同結(jié)構(gòu)形式 Cys C(單體和寡聚體)對缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細胞的增殖及凋亡的影響及其機制提供一定的理論依據(jù)，也為進一步研究急性腦缺血后血清Cys C寡聚體表達水平升高與血管性癡呆的發(fā)生、發(fā)展的關系提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2016年5-8月在我院腦卒中單元及神經(jīng)內(nèi)科住院治療的急性腦缺血患者32例(急性腦缺血組)，所有病例均符合納入及排除標準。選擇同期在我院健康體檢中心體檢的健康人群26例作為對照組，均符合排除標準。2組患者一般臨床資料對比比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。急性腦缺血的診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》2010版制定的標準[1]；入組患者發(fā)病在14 d以內(nèi)且臨床首次考慮急性腦梗死者。排除患有影響血清Cys C表達水平疾病者,合并有心、肝、肺及腎功能不全者,既往有腦血管病史者。

表1 2組患者相關臨床資料的比較

1.2 研究方法

1.2.1 入院評估：采用美國國立研究院卒中評分量表對入組急性腦缺血患者進行NIHSS評分[2]，并根據(jù)評分結(jié)果進行如下分組：輕度，評分0～9分；中度，評分10～19分；重度，評分20分以上者。

1.2.2 血清 Cys C檢測：用ELISA蛋白檢測法檢測，試劑盒由武漢博士德生物科技公司提供。入組研究對象要求禁食8 h或以上，次日早晨采集空腹靜脈血10 mL，離心分離血清，待檢。血清Cys C濃度0.51～1.03 mg/L為正常水平。

1.2.3 血清Cys C結(jié)構(gòu)形式的檢測：用免疫沉淀-Western blotting 蛋白檢測法，先將免疫沉淀所得樣品100 ℃煮沸變性，行SDS-PAGE 電泳凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜將凝膠中蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(Odyssey)采集分析圖像，按不同分子量分析 Cys C 結(jié)構(gòu)形式：單體13 kD，寡聚體13n kD(n為≥2的整數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 2組患者Cys C表達水平比較：急性腦缺血組患者Cys C濃度為(1.086±0.658)mg/L，高于對照組的(0.687±0.099)mg/L，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 2組患者血清中Cys C寡聚體率比較： 將免疫沉淀后血清樣本進行Westen blotting檢測，結(jié)果顯示87.5%的急性腦缺血患者血清樣本中Cys C 呈寡聚體形式，而對照組血清樣本只有19.2%的寡聚體化，大多數(shù)仍表現(xiàn)為單體，見表2。

表2 2組患者Cys C寡聚體的比較[n(%)]

注：*與對照組比較，χ2=27.26,P<0.05。

2.3 急性腦缺血不同程度組Cys C表達水平比較：32例患者中輕度組26例，中度組6例。采用Wilcoxon秩和檢驗比較不同程度分組患者的Cys C值，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同程度患者Cycs C比較

3 討論

Cys C屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，是一種小分子堿性蛋白，廣泛存在于各種體液中，但以腦脊液水平最高。近期研究顯示，Cys C最重要的生理功能是參與細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)水解的調(diào)控,通過調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶及基質(zhì)金酶的活性，而維持機體的正常代謝[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，Cys C可以自由通過腎小球，其血清濃度不受體重等因素影響，是優(yōu)于傳統(tǒng)血清肌酐的評價腎小球率過濾的新指標[4]。陳正徐[5]等研究指出，Cys C可以被認為是糖尿病腎病 (DN)腎功能早期受損的標志物。Cys C與組織蛋白酶相互作用共同參與機體的多種病理生理過程，包括炎癥的發(fā)生與發(fā)展、抗原呈遞、腫瘤轉(zhuǎn)移、病原體入侵以及心腦血管疾病等[6]。Kiyosue 等[7]研究提示，Cys C可作為評估冠狀動脈疾病患者病情嚴重程度的有用指標。國內(nèi)外一些研究指出，Cys C可能與腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，以及血管性癡呆的發(fā)生、發(fā)展有關。

關于血清Cys C濃度與急性腦缺血之間的關系，目前尚缺乏統(tǒng)一定論，主要存在的觀點包括以下兩方面：①大部分研究表明血清Cys C水平升高，與急性腦梗死發(fā)病之間存在了誘導性關系，Cys C 很大程度上屬于急性腦梗死發(fā)生、發(fā)展的危險性因素[8]。另外有學者認為Cys C表達水平和亞臨床型腦梗死發(fā)病之間存在著密切關聯(lián)，它屬于亞臨床型腦梗死的一項尤為重要的危險性參考標準[9]。姚恩生[10]等研究結(jié)果表明，Cys C 水平在腦梗死急性期是明顯增高的，且存在意識障礙、大面積腦梗死者Cys C 水平明顯高于小面積腦梗死及無意識障礙者，血清Cys C 水平升高可能影響急性腦梗死病情嚴重程度及預后。郭方圓[11]及張?zhí)頪12]等都指出，Cys C 水平升高是急性腦梗死的一個危險指標，且該物質(zhì)與急性腦梗死的發(fā)生、病情輕重、近期預后等均密切相關。②還有少部分研究認為，血清Cys C屬于急性腦梗死發(fā)病的一種保護機制，趙德強等[13]經(jīng)對83例腦缺血患者全血Cys C水平的分析，發(fā)現(xiàn)急性腦缺血組患者Cys C水平較對照組低，考慮此種保護作用與半胱氨酸上的巰基之間有密切關聯(lián)。本研究結(jié)果表明，急性腦缺血患者血清中 Cys C表達水平較對照組升高，這與以往國內(nèi)外大多數(shù)研究結(jié)果相吻合。Cys C在急性腦缺血組血清中表達升高的機制，我們推測可能如下：①Cys C作為內(nèi)源性組織蛋白酶抑制劑，在發(fā)揮作用過程中可能影響血管壁的重構(gòu)，因此參與到血管硬化過程中，然而多數(shù)急性腦缺血患者血管存在不同程度的動脈硬化[14]。②在缺血急性期，腦脊液中Cys C可能破壞血腦屏障進入血循環(huán)，表現(xiàn)為血清Cys C表達水平增高。③急性腦缺血病程早期可能存在腦組織水腫，造成顱內(nèi)壓升高，應激性腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，神經(jīng)-內(nèi)分泌功能紊亂，腎小球率過濾下降，導致經(jīng)腎臟排出Cys C減少，表現(xiàn)為血清中Cys C表達增高。對于Cys C表達水平與急性腦缺血嚴重程度之間的關系，本研究與既往很多研結(jié)果存在分歧。本文通過對不同NIHSS評分結(jié)果急性腦缺血患者之間的比較，提示血清Cys C的表達水平與急性腦缺血患者NIHSS評分無明顯關系，考慮可能有如下影響因素：①Cys C表達受多種未知因素的影響，臨床中我們未能將不同程度急性腦缺血的影響因素做到統(tǒng)一；②本研究隨機收集病例，并根據(jù)入院當天NIHSS評分將病例進行分組，造成各組比例數(shù)差距較大，這種不可控因素可能對研究結(jié)果造成影響，對研究結(jié)果造成偏差。后期為進一步得到更為可靠的結(jié)果，將會擴大樣本量或統(tǒng)一各個等級NIHSS評分的病例數(shù)進行研究。

Cys C作為組織蛋白酶抑制劑而發(fā)揮作用，同時其自身易受某些病理因素的影響，本身的活性也會被Cathepsin D或者彈性蛋白抑制而發(fā)生突變。早些年有研究[15]報道，在高溫、低pH或變性劑存在情況下，重組Cys C易被誘導轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠w形式。吳志新曾在Cys C的腦保護作用及其臨床應用研究進展一文中指出，Cys C基因突變形成的Cys C蛋白容易形成穩(wěn)定的二聚體，其二聚體又以淀粉樣纖維素形式沉積在血管壁上，從而形成腦淀粉樣血管病，眾所周知淀粉樣物質(zhì)在腦組織內(nèi)沉積則會增加老年人罹患AD或VD的風險[16]。Xu[17]等研究也表明，突變型Cys C可以形成淀粉樣蛋白沉積于血管壁而影響血管健康，與腦血管淀粉樣病和AD有關。Levy等[18]報告，在一些腦血管疾病患者大腦中發(fā)現(xiàn)有寡聚化或者多聚化的Cys C存在。本研究初步猜想，這種寡聚體形式的Cys C會不會與急性腦缺血有某種關系將進一步實驗證實，急性腦缺血患者血清Cys C增高是以寡聚體形式為主，這與既往研究結(jié)果相符。結(jié)合以往多項研究，我們推測Cys C寡聚體可能會影響或者加劇急性腦缺血患者認知功能的改變，最終導致VD的發(fā)生并影響其發(fā)展。也有研究指出，血清Cys C 濃度的高低可能與患者認知功能的好壞呈反比關系[19]。對于Cys C 如何影響急性腦缺血患者認知功能，有研究推測，可能與細胞增殖凋亡、氧化應激反應、 β樣淀粉蛋白的分泌增加、淀粉樣血管病變、神經(jīng)元的再生及變性等相關[20]。下一步將研究在細胞層面研究不同結(jié)構(gòu)形式 Cys C(單體和寡聚體)對缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細胞的增殖及凋亡的影響及其機制，急性腦缺血后血清寡聚體Cys C表達水平升高與血管性癡呆的發(fā)生、發(fā)展的關系。

綜上所述，急性腦缺血患者血清Cys C水平升高，且以寡聚體升高為主，血清Cys C水平與急性腦缺血嚴重程度無明顯關系。本研究的完成，將為下一步在細胞層面研究不同結(jié)構(gòu)形式Cys C(單體和寡聚體)對缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細胞的增殖及凋亡的影響及其機制提供理論依據(jù)。因受樣本量限制，本研究結(jié)果可能存在片面性，在后期的研究中可以考慮擴大樣本量，對臨床中急性腦缺血患者血清Cys C表達水平進行隨訪性監(jiān)測，以期尋找血清Cys C的表達水平的界值，為預測和防治VD提供理論依據(jù)。

[1] 中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南[J].中國醫(yī)學前沿雜志，2010，14(12B)：4013-4017.

[2] 王萬卿，任增璽，李萬軍，等.間接血管重建術治療側(cè)支循環(huán)功能不全性缺血性腦血管病[J].河南外科學雜志，2014，20(6)：26-27.

[3] 魯思文，符布清，羅君，等.急性腦梗死患者血清胱抑素C及血脂水平的觀察及意義[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2011，32(20)：2394-2395.

[4] 項亞娟，廖莉，彭曉江，等.皮質(zhì)下缺血性血管病血清胱抑素C水平變化及其與神經(jīng)影像學特征之間關系[J].安徽醫(yī)藥，2013，17(5)：771-774.

[5] Kiyosue A,Hirata Y,Ando J,et al.Plasma cystatin C concentration reflects the severity of coronary artery disease in patients without chronic kidney disease[J].Circulation Journal,2010,74(11):2441-2447.

[6] Salgado JV,Souza FL,Salgado BJ.How to understand the association between cystatin C levels and cardiovascular disease:Imbalance,counterbalance,or consequence[J].Journal of Cardiology,2013,62(6):331-335.

[7] 陳正徐，王莉，李曼.血尿Cys C在糖尿病腎病早期檢測中的應用價值[J].安徽醫(yī)藥，2011，15(10)：1272-1273.

[8] 李婷，張云松，穆劍強.血清胱抑素C與腦梗死發(fā)病相關性的臨床研究[J].中外醫(yī)療，2015，2(6)：81-82.

[9] 王大力，何曉娟，安雅臣，等.血清胱抑素C與腦梗死后血管性認知障礙關系的研究[J].中華老年心腦血管病雜志，2013，15(7)：684-686.

[10] 姚恩生，唐燕，王宏，等.血清尿酸、胱抑素 C與急性腦梗死的相關性研究[J].農(nóng)墾醫(yī)學，2014，36(4)：294-296.

[11] 郭方圓，李正儀.血清胱抑素C與腦梗死發(fā)病相關性的臨床研究[J].西安交通大學學報(醫(yī)學版)，2011，32(4)：497-500.

[12] 張?zhí)睿鯃?血清胱抑素C與急性腦梗死發(fā)病及近期預后的相關性分析[J].中風與神經(jīng)疾病雜志，2013，30(10)：935-936.

[13] 趙德強，潘速躍，陳建輝，等.腦梗死與胱抑素C的關系[J].南方醫(yī)科大學學報，2009，29(4)：807-808.

[14] Yamashita H,Nishino T,Obata Y,et al.Association between cystatin C and arteriosclerosis in the absence of chronic kidney disease[J].Journal of Atherosclerosis and Thrombosis,2013,20(6):548-556.

[15] Ekiel I,Abrahamson M.Folding-related dimerization of human cystatin C[J].Journal of Biological Chemistry,1996,271(3):1314-1321.

[16] 吳志新，董海龍，熊利澤.胱抑素C的腦保護作用及其臨床應用研究進展[J].神經(jīng)解剖學雜志，2014，30(4)：503-506.

[17] Xu Yuekang,Ding Ying,LI Xinchen,et al.Cystatin C is a disease associated protein subject to multiple regulation[J].Immunology and Cell Biology,2015,93(5):442-451.

[18] Levy E,Jaskolski M,Grubb A.The role of cystatin C in cerebral amyloid angiopathy and stroke:cell biology and animal models[J].Brain Pathology,2006,16(1):60-70.

[19] Ghidoni R,Benussi L,Glionna M,et al.Plasma cystatin C and risk of developing Alzheimer's disease in subjects with mild cognitive impairment[J].Journal of Alzheimer's Disease,2010,22(3):985-991.

[20] Ghidoni R,Paterlini A,Albertini VA,et al.Cystatin C is released in association with exosomes:a new tool of neuronal communication which is unbalanced in Alzheimer's disease[J].Neurobiology of Aging,2011,32(8):1435-1442.