水分脅迫和鹽分脅迫對粗糙龍膽種子萌發(fā)的影響

陶 玲，尹海波，李 旭，邵 飛，賈曉晴

（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連116600）

龍膽為我國常用中藥，2015版藥典規(guī)定其來源為龍膽科（Gentianaeeae）植物條葉龍膽（Gentiana manshuricaKitag.）、龍膽（Gentiana scabraBge.）、三花龍膽（Gentiana triflorapall.）或堅龍膽（Gentiana rigescensFranch.）的干燥根及根莖。前3種習稱“關龍膽”，后一種習稱“堅龍膽”，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效［1］。關龍膽被稱為遼藥六寶之一，市場需求量大，近年來野生資源處于瀕危狀態(tài)，人工栽培龍膽成為市場的主要藥材來源。遼寧省撫順市清原縣擁有遼寧最大的龍膽栽培基地，栽培品種為龍膽（Gentiana scabraBge.），即粗糙龍膽。全縣龍膽草種植面積達2 466 hm2，年產(chǎn)量1 600 t，占全國市場份額的82%。但龍膽草種子細小，千粒重僅為24～32 mg［2］，加之近年來水資源供應的短缺以及土壤鹽漬化等問題的凸顯，直播發(fā)芽率較低。本實驗人工模擬水分及鹽分2種環(huán)境脅迫，研究不同干旱程度、不同鹽分濃度下龍膽種子的發(fā)芽特性，為粗糙龍膽人工栽培和規(guī)范化種植提供指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗用龍膽種子為2016年9月采于撫順市清原縣英額門鎮(zhèn)英額門村的3年生成熟種子。

1.2 方 法

1.2.1 水分脅迫對龍膽種子萌發(fā)的影響

將PEG6000用去離子水溶解，分別配制成5%、10%、15%、20%的溶液，p H＝7.0的去離子水處理組作為對照組。取成熟飽滿的種子適量，1%次氯酸鈉浸泡消毒15 min后，用去離子水沖洗掉表面殘留的次氯酸鈉溶液。將2層濾紙放置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿經(jīng)酒精消毒。每個培養(yǎng)皿放置100粒成熟飽滿的種子。用一次性針管吸取5 m L處理液于各處理組中，共5個處理組，每處理3次重復，放入25℃人工氣候箱中培養(yǎng)，光周期為11 h光照／13 h黑暗。用稱重法補充每天損失的水分。

1.2.2 鹽分脅迫對龍膽種子萌發(fā)的影響

將分析純的 NaCl分別配制成45，90，135，180，225 mmol／L的溶液，p H＝7.0的去離子水處理組作為對照組。種子前期處理方法與1.2.1一致。用一次性針管吸取5 m L處理液于培養(yǎng)皿中，每皿100粒種子。共6個處理組，每處理3次重復，放入25℃人工氣候箱中培養(yǎng)，光周期為11 h光照／13 h黑暗。用稱重法補充每天損失的水分。

1.2.3 種子萌發(fā)指標的測定

置床72 h后每天同一時間觀察種子萌發(fā)情況（本實驗規(guī)定置床之日為1），當種子露白（胚根突破種皮1 mm時）時視為萌發(fā)［3］。種子停止萌發(fā)時每個培養(yǎng)皿隨機抽取3株幼苗測量其長度。

發(fā)芽率（%）＝正常發(fā)芽的種子數(shù)／供試種子總數(shù)×100%；

相對發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽種子數(shù)占對照萌發(fā)種子數(shù)的百分比；

發(fā)芽勢＝發(fā)芽種子數(shù)達到高峰時正常發(fā)芽種子總數(shù)與供檢種子總數(shù)的百分比；

“雙十一”購物狂歡節(jié)，是指每年11月11日的網(wǎng)絡促銷日，源于淘寶商城（天貓）2009年11月11日舉辦的網(wǎng)絡促銷活動。下面我將列舉從2009年至2017年“雙十一”天貓和淘寶的總銷售額以及各年銷售額的增長率，如表所示：

發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑（Gt／Dt）（式中，Gt為不同時間（t，d）的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽試驗天數(shù)）

活力指數(shù)（VI）＝GI×S（式中，S為一定時期內(nèi)幼苗長度cm，GI為發(fā)芽指數(shù)）；

平均發(fā)芽速度＝∑（D×n）／∑n（式中，D為從種子置床起算的天數(shù)，n為相應各天的發(fā)芽粒數(shù)）；

種子耐鹽適宜范圍＝發(fā)芽率達到對照發(fā)芽率75%時相對應的鹽液濃度；

種子耐鹽半致死濃度＝發(fā)芽率達到對照發(fā)芽率的50%的鹽液濃度；

種子耐鹽極限濃度＝發(fā)芽率達到對照發(fā)芽率的10%的鹽液濃度。

1.3 統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016與SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對龍膽種子發(fā)芽率的影響

由圖1可知，隨著NaCl濃度的遞增，種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)出明顯降低的趨勢。對照組的發(fā)芽率最高，為68%，而濃度225 mmol／L處理組的龍膽種子未見萌發(fā)。NaCl濃度與種子發(fā)芽率呈顯著負相關（p＜0.05），回歸方程為y＝－13.210x＋68.067，R2＝0.851 0。方差分析表明，45 mmol／L濃度組與對照組發(fā)芽率比較有顯著性差異（p＜0.05），其他濃度組與對照組比較有極顯著性差異（p＜0.01）。說明即使低濃度的鹽分脅迫，也會抑制龍膽種子的萌發(fā)，這與鄭偉等［4］，徐芬芬等［5］得出的低濃度鹽脅迫促進種子萌發(fā)的結論并不相符，龍膽種子極其不耐鹽。

圖1 NaCl脅迫對龍膽種子發(fā)芽率的影響

2.1.1 NaCl脅迫對龍膽種子相對發(fā)芽率的影響

為進一步研究龍膽種子的耐鹽程度，將相對發(fā)芽率與相對應的鹽濃度之間進行相關回歸分析（如圖2）。結果表明，NaCl脅迫下的相對發(fā)芽率隨鹽溶液濃度的升高而降低，相對發(fā)芽率與NaCl溶液濃度表現(xiàn)出顯著的負相關（p＜0.05），相關系數(shù)為0.851 0，回歸方程為：y＝－19.427x＋100.10。以相對發(fā)芽率的75%、50%、25%時所對應的NaCl濃度作為龍膽種子發(fā)芽時鹽脅迫的適宜值、臨界值和極限值。得出NaCl脅迫時，龍膽種子在萌發(fā)期間鹽脅迫的適宜值為13.15 mmol／L，臨界值為71.06 mmol／L，極限值為128.97 mmol／L。

2.1.2 NaCl脅迫對龍膽種子發(fā)芽速度的影響

由圖3可知，各濃度下龍膽種子發(fā)芽的動態(tài)變化，總體呈現(xiàn)出慢快慢的趨勢，其中對照組趨勢最為明顯，第6天到第9天種子萌發(fā)速度快、數(shù)量多。45 mmol／L和90 mmol／L濃度組在發(fā)芽后期速度有小幅度的上升。135 mmol／L和180 mmol／L 2個濃度組趨勢較為相似，比較平緩，225 mmol／L濃度下，種子未見萌發(fā)。由圖3可以看出，不同濃度的NaCl不僅可以影響發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽速度等指標，還會對種子的初始發(fā)芽時間造成影響。對照組從第5天開始萌發(fā)，低濃度組（45～90 mmol／L）均從第7天開始萌發(fā)，135～180 mmol／L組從第10天開始萌發(fā)。種子初始發(fā)芽時間隨著NaCl濃度增大不斷延后。供試種子發(fā)芽所需的平均時間稱為平均發(fā)芽速度，它是衡量種子發(fā)芽快慢的一個指標，在同一種類種子中，平均發(fā)芽速度的數(shù)值小，表示該批種子的發(fā)芽速度大，發(fā)芽能力越好［6］。在龍膽種子的整個萌發(fā)時間段內(nèi)計算種子的平均發(fā)芽速度（見表1），可知隨著NaCl濃度的遞增，種子的平均發(fā)芽速度不斷增大，種子的發(fā)芽能力隨之降低。

表1 NaCl脅迫對龍膽種子萌發(fā)指標的影響

圖2 NaCl脅迫對龍膽種子相對發(fā)芽率的影響

圖3 NaCl對龍膽種子累計發(fā)芽率的影響

2.1.3 NaCl脅迫對龍膽種子發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、種子活力指數(shù)等指標的影響

計算龍膽種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、幼苗長度、種子活力指數(shù)等指標，結果見表1。由表1可知，龍膽種子在不同濃度NaCl溶液脅迫下，整體發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、種子活力指數(shù)、幼苗長度均隨著NaCl溶液濃度的增高呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（p＜0.05）。種子活力其余濃度組與對照組比均有顯著性差異（p＜0.05）。說明低濃度的NaCl溶液（＜45 mmol／L）可降低龍膽種子的活力，進一步表明龍膽種子在低濃度鹽脅迫下不存在促進其發(fā)芽的情況。高濃度NaCl溶液明顯減弱種子活力，強烈抑制其萌發(fā)。

2.2 水分脅迫對龍膽種子發(fā)芽率的影響

能夠充分反映種子萌發(fā)情況的指標是發(fā)芽率，由圖4可知，除了PEG濃度為5%的處理組比對照組發(fā)芽率稍有增高外，其余3組發(fā)芽率均隨著PEG濃度的增高而呈下降趨勢。對各組發(fā)芽率進行差異顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)，5%，10%濃度組與對照組相比無顯著性差異，15%濃度組，20%濃度組與對照組比有極顯著性差異（p＜0.01）。其中5%濃度組的發(fā)芽率比對照組還略有提高。說明適度的干旱刺激可以提高龍膽種子的發(fā)芽率。

2.2.1 水分脅迫對龍膽種子發(fā)芽速度的影響

由圖5可知，龍膽種子在整個萌發(fā)期間內(nèi)，整體呈現(xiàn)出慢快慢的生長趨勢。對照組、5%濃度組、10%濃度組皆從第5天開始萌發(fā)，15%濃度組第8天開始萌發(fā)，20%濃度組始終未見萌發(fā)。種子萌發(fā)多集中在6～12 d。15 d后處于萌發(fā)的停滯期。第7天后，5%濃度組每天的累計發(fā)芽率皆大于對照組。計算龍膽種子的平均發(fā)芽速度（平均發(fā)芽速度值越小，發(fā)芽能力越強）見表2，隨著PEG濃度的增加，種子的平均速度隨之遞增，但5%濃度組與對照組比無顯著性差異，由此可見，低質(zhì)量分數(shù)的PGE可以促進種子萌發(fā)，增大種子萌發(fā)速度，降低其平均萌發(fā)速度，高質(zhì)量分數(shù)的PEG延緩種子發(fā)芽時間，減慢種子發(fā)芽速度，抑制種子萌發(fā)。

表2 水分脅迫對龍膽種子萌發(fā)的影響

圖4 水分脅迫對龍膽種子發(fā)芽率的影響

圖5 PEG對龍膽種子累計發(fā)芽率的影響

由表2可知，PEG質(zhì)量分數(shù)在0～5%范圍內(nèi)，龍膽種子的發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢呈升高的趨勢，而后隨著PEG濃度的加大，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)逐步降低。對照組和5%濃度組的種子日發(fā)芽數(shù)在第8天達到最高，故2組種子的發(fā)芽勢定在第8天測定，分別為34.67%和36.67%。10%濃度組種子的發(fā)芽勢定在第10天，為28%。15%濃度組發(fā)芽勢延遲到第12天，為24.67%。由此可見，PEG質(zhì)量分數(shù)的加大，會導致發(fā)芽勢天數(shù)的延后，減弱種子的萌發(fā)能力。其中5%濃度組和10%濃度組種子的發(fā)芽指數(shù)與對照組相比無顯著性差異，15%濃度組與對照組比較有顯著性差異（p＜0.05），20%濃度組與對照組比較有極顯著性差異（p＜0.01）。說明此時PEG濃度超過了龍膽種子萌發(fā)過程的滲透調(diào)節(jié)承受限度，對種子的萌發(fā)和生長均造成傷害。

2.2.2 水分脅迫對龍膽種子活力指數(shù)、幼苗長度及根莖比的影響

植物的正常生長需要合理的根莖比，如果根莖比過小，地上部分的水分和養(yǎng)分便難以輸送到植物上部，植株也不會正常生長［6］。由表2可知，本次實驗的根莖比、幼苗長度、種子活力指數(shù)均隨著PEG濃度的增大而隨之降低。根莖比5%濃度組與對照組數(shù)值相同，10%濃度組與對照組比差異不顯著（p＞0.05），并有增大趨勢。15%濃度組和20%濃度組與對照組比有極顯著性差異（p＜0.01）。種子活力指數(shù)只有5%濃度組與對照組比無顯著性差異，其余3組均與對照組有顯著性差異（p＜0.05）。說明低濃度的PEG可以一定程度的促進種子萌發(fā)，對種子活力也不會過分抑制，進一步證明了龍膽種子具有一定的耐旱性。

3 結論與討論

本實驗分別采用培養(yǎng)皿中添加不同濃度NaCl處理液和利用PEG6000人工模擬干旱條件2種方法，比較鹽分和水分2種環(huán)境脅迫對龍膽種子萌發(fā)的影響。試驗相關分析表明，龍膽種子的發(fā)芽率與NaCl濃度之間呈現(xiàn)顯著的負相關，種子發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、幼苗長度、活力指數(shù)均隨著NaCl的增大呈顯著下降的趨勢，225 mmol／L濃度組始終未見萌發(fā)。通過回歸分析得出，NaCl脅迫時，龍膽種子在萌發(fā)期間鹽脅迫的適宜值為13.15 mmol／L，臨界值為71.06 mmol／L，極限值為128.97 mmol／L。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的鹽脅迫可以促進種子萌發(fā)［7］，而本次試驗中即使低濃度（45 mmol／L）的NaCl脅迫仍可以顯著抑制龍膽種子的萌發(fā)，發(fā)芽率與對照組比有顯著性差異（p＜0.05）。說明龍膽種子不耐鹽，應盡量避免將龍膽種子播種在鹽漬化的土壤中。

當PEG濃度為5%時，龍膽種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均較對照組有小幅度的上升，根莖比與對照組比有下降趨勢但無顯著性差異。說明適當濃度的PEG可以促進種子萌發(fā)，提高種子發(fā)芽率。10%濃度組的發(fā)芽率、根莖比、幼苗長度與對照組比無顯著性差異，15%～20%濃度組發(fā)芽率，根莖比與對照組比有極顯著性差異（p＜0.01）。種子活力指數(shù)除了5%濃度組與對照組比無顯著性差異外，其余3組都有顯著性差異（p＜0.05），當PEG濃度達到20%時，種子未見萌發(fā)?？梢婟埬懛N子在萌發(fā)期間可承受的PEG濃度在10%以內(nèi)，濃度達到15%時無論是對種子萌發(fā)還是幼苗生長均會造成顯著抑制，龍膽種子不能萌發(fā)的PEG濃度的臨界值為20%。龍膽種子的根莖比在PEG質(zhì)量分數(shù)達到10%時有小幅度上升，有可能是龍膽種子對干旱脅迫環(huán)境的適應性，有利于種子在逆境脅迫下更好的吸收水分［6］。

龍膽草屬于藥用植物，其藥效成分主要是次生代謝產(chǎn)物。環(huán)境脅迫能夠顯著影響藥用植物的次生代謝等指標，雖抑制了植物的生長發(fā)育，但也會促進其次生代謝產(chǎn)物的分泌。有研究分析了蒼術根際區(qū)土壤養(yǎng)分的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)道地藥材茅山蒼術在生長發(fā)育過程中受到了較嚴重的養(yǎng)分缺乏脅迫，主要表現(xiàn)為缺鉀脅迫［8］。與水分充足時相比，萬壽菊在受到水分脅迫時，自身所含酚類物質(zhì)含量明顯增高［9］。何丙輝等研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫促進了銀杏中槲皮素含量的提高，抑制了蘆丁含量的增加［10］。本研究得出結論，粗糙龍膽種子極其不耐鹽但可以抵御一定程度的干旱脅迫，干旱脅迫環(huán)境對龍膽中主要藥效成分環(huán)烯醚萜苷類的累計是否有促進作用，還需要進行下一步的試驗證明。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：96.

［2］趙敏.龍膽種子萌發(fā)與水溶性抑制物質(zhì)［J］.植物生理學通訊，2004，40（6）：677679.

［3］黃振英，張新時，Yitzchak GUTTERMAN，等.光照、溫度和鹽分對梭梭種子萌發(fā)的影響［J］.分子植物，2001，27（3）：275280.

［4］鄭偉，王彬，蔡永強，等.NaCl脅迫對火龍果種子萌發(fā)的影響［J］.種子，2008，27（1）：8284.

［5］徐芬芬，杜佳朋.干旱脅迫和鹽脅迫對芝麻種子萌發(fā)的影響［J］.種子，2013，32（11）：8586.

［6］陳培，汪強，趙莉，等.水分脅迫對芝麻種子萌發(fā)特性的影響［J］.種子，2012，31（4）：8385.

［7］塔依爾，張鳳華，周建文，等.鹽脅迫對烏拉爾甘草種子萌發(fā)的影響研究［J］.種子，2010，29（7）：2129.

［8］郭蘭萍，黃璐琦，邵愛娟，等.蒼術根際區(qū)土壤養(yǎng)分變化規(guī)律［J］.中國中藥雜志，2005，30（19）：1 5041 507.

［9］Tang C S，Cai W F，Kohl K，et al.Plant stress and allelopathy［J］.Acs Symposium，1994.

［10］何丙輝，鐘章成.不同環(huán)境脅迫下銀杏構件種群藥用成分變化的研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學學報，2003，25（1）：710.