玉米種子生產(chǎn)基地品種轉(zhuǎn)基因成分快速檢測的策略

劉 冰，楊娟妮，張海波，張 英，張 田，周 波

（1.陜西省種子管理站，西安710018； 2.陜西省農(nóng)作物種子檢驗站，西安710018）

玉米是世界上種植范圍最廣的谷物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)十分重要的地位。我國是玉米生產(chǎn)和消費大國，播種面積、總產(chǎn)量、消費量僅次于美國，均居世界第2位［1］。2015年我國玉米產(chǎn)量22 458.0萬t，占糧食總產(chǎn)量62 143.5萬t的近三分之一［2］。作為我國第一大糧食作物，玉米不僅可以作為糧食食用，也可以用作工業(yè)產(chǎn)品的原材料和動物飼料。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究與發(fā)展為玉米遺傳改良技術(shù)提供了廣闊的前景，玉米被賦予了新的優(yōu)良性狀，如抗蟲、耐除草劑、節(jié)水抗旱、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等［3］。

隨著全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積逐年增加，所帶來的安全問題已成為從科學(xué)界到經(jīng)濟(jì)社會各個方面關(guān)注和爭議的焦點。因此，我國一方面在加大轉(zhuǎn)基因研發(fā)投入，占領(lǐng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)制高點，同時也在強化對轉(zhuǎn)基因安全的監(jiān)管，保障我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)有序、健康發(fā)展。而快速、準(zhǔn)確、多樣化的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)手段是加強農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管的重要技術(shù)支撐。

1 全球轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化現(xiàn)狀

據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）2015年的最新報告，全球28個國家共種植轉(zhuǎn)基因作物1.797億hm2，較1996年最初種植的170萬hm2增長了100倍。其中有17個國家種植轉(zhuǎn)基因玉米，占全球玉米種植面積的30%以上。國際上轉(zhuǎn)基因玉米的產(chǎn)業(yè)化已由種植抗蟲或抗除草劑為主的單一性狀階段發(fā)展到以復(fù)合性狀（既抗蟲又抗除草劑或抗多種害蟲）為主的聚合多基因玉米應(yīng)用階段。未來發(fā)展方向是研發(fā)具有不同殺蟲機理、不同性狀多基因復(fù)合／疊加的轉(zhuǎn)基因玉米［34］。

我國尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因玉米的商業(yè)化種植，但已批準(zhǔn)部分國外的轉(zhuǎn)基因玉米品種作為加工用途進(jìn)口。截至2016年6月，國內(nèi)外商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件主要有27個［57］（不包括疊加品系），我國允許作為加工用途進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因玉米的轉(zhuǎn)化事件有16個［8］，分別為3個耐除草劑玉米GA 21、NK 603、T 25，9個抗蟲玉米 MON 89034、MON 810、MON 863、MIR 604、Bt 11、TC 1507、59122、Bt 176、MIR 162，2個抗蟲耐除草劑玉米MON 88017、Bt 11×GA 21，1個耐旱玉米MON 87460和1個品種改良玉米Event 3272［9］。

2 轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)

2.1 DNA檢測技術(shù)

目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品分子檢測的方法主要包括DNA檢測和蛋白質(zhì)檢測的方法，其中基于DNA的PCR檢測技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中應(yīng)用最廣。PCR檢測技術(shù)可以檢測樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分（即篩查法），含有什么基因成分（即基因特異性檢測）以及來自哪個轉(zhuǎn)基因品種（即品系特異性檢測）［910］。PCR篩查法靈敏度高、特異性強，可檢出的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化事件多，但需要在實驗室內(nèi)完成，檢測周期長，對儀器設(shè)備等硬件設(shè)施和人員操作水平要求較高。該方法也是我國種子檢測機構(gòu)普遍使用的轉(zhuǎn)基因成分檢測方法。

2.2 蛋白質(zhì)檢測技術(shù)

蛋白質(zhì)檢測技術(shù)是基于免疫學(xué)抗原抗體互補結(jié)合的原理，主要針對轉(zhuǎn)基因植物外源目的基因表達(dá)的目的蛋白而建立的特異性檢測方法。蛋白質(zhì)檢測主要包括酶聯(lián)免疫吸附法和側(cè)向流動型免疫試紙條方法2種［11］。試紙條方法具備以下優(yōu)點：1）操作簡單，對人員操作水平要求不高，無需專門的儀器設(shè)備，適合外出攜帶，現(xiàn)場檢測；2）測速度快，一般從樣品處理到結(jié)果顯示只需要5 min；3）具備一定的特異性和靈敏度。免疫學(xué)檢測方法要求被檢測的蛋白質(zhì)必須具有完整的空間結(jié)構(gòu)，因此具有一定的局限性，主要適用于新鮮和未處理的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的快速檢測［11］。

2.3 商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因檢測試紙條

市場上主要有4個品牌的轉(zhuǎn)基因檢測試紙條應(yīng)用較廣，美國envirologix，美國agdia和國產(chǎn)的上海佑隆和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所。4個品牌的轉(zhuǎn)基因檢測試紙條各有優(yōu)缺點。美國envirologix試紙條種類最多，不同作物有專用的檢測試紙條，可以檢測Cry系列的多種抗蟲蛋白、Vip 3 A抗蟲蛋白和多種耐除草劑蛋白，檢出限理論值依據(jù)作物不同可達(dá)0.1%～0.5%，該試紙條的缺點是價格比較昂貴，1次反應(yīng)成本約32元。美國agdia試紙條不分作物種類，可以檢測的項目較少，僅能檢測部分抗蟲蛋白和耐除草劑蛋白CP 4 EPSPS，檢出限理論值可達(dá)0.1%～0.5%，該試紙條的價格也比較昂貴，1次反應(yīng)成本約30元。國產(chǎn)的上海佑隆試紙條不分作物種類，可以檢測的項目較少，僅能檢測Cry 1 Ab，Cry 1 Ac等4種抗蟲蛋白和耐除草劑蛋白CP 4 EPSPS，抗蟲蛋白檢出限理論值可達(dá)1%，耐除草劑蛋白檢出限理論值可達(dá)0.2%。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試紙條不分作物種類，可以檢測抗蟲蛋白Cry 1 Ab／Cry 1 Ac和耐除草劑蛋白Bar，CP 4 EPSPS，該試紙條檢出限理論值可達(dá)0.1%。國產(chǎn)試紙條的價格比較便宜，1次反應(yīng)成本約11元。實際工作中檢測機構(gòu)可以根據(jù)檢測作物、檢測項目和檢測經(jīng)費的狀況選擇適合自身狀況的品牌。

3 玉米種子生產(chǎn)基地品種轉(zhuǎn)基因成分快速檢測的策略

近年來，種子監(jiān)督管理過程中發(fā)現(xiàn)部分地區(qū)存在非法繁育轉(zhuǎn)基因作物的現(xiàn)象。為了打擊轉(zhuǎn)基因玉米非法繁育的行為，更好地保障農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全，加強種子生產(chǎn)環(huán)節(jié)的轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管，特別是轉(zhuǎn)基因成分的現(xiàn)場快速檢測十分重要。

3.1 快速檢測的總體要求

按照《中華人民共和國種子法》（以下簡稱《種子法》）、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》等法律規(guī)定和“屬地管理、部門協(xié)調(diào)、檢打聯(lián)動”的原則，省、市、縣三級種子管理部門協(xié)調(diào)配合，對轄區(qū)內(nèi)的制種基地和種子生產(chǎn)基地等重點區(qū)域開展拉網(wǎng)式排查，現(xiàn)場抽樣快速檢測并詳細(xì)記錄抽樣地塊地理信息。

3.2 快速檢測的取樣時期與部位

3.2.1 轉(zhuǎn)基因玉米中Bt蛋白與CP 4 EPSPS蛋白表達(dá)的時空規(guī)律

轉(zhuǎn)Bt基因玉米組織器官中Bt蛋白表達(dá)量隨著玉米生育期的變化而呈時空動態(tài)變化，就時期而言不同的生長發(fā)育階段（苗期、抽絲期和乳熟期），葉片中Bt蛋白的含量隨生育期的推移呈明顯先上升后下降趨勢，Bt蛋白含量在抽絲期達(dá)到最大，之后又開始下降。就器官而言，玉米的整個生育期內(nèi)Bt蛋白的平均含量一般是葉片最高，莖和根次之，籽粒，苞葉和花絲最低［1213］。關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米中耐除草劑蛋白表達(dá)量的研究較少，僅有部分文獻(xiàn)報道轉(zhuǎn)基因玉米中CP 4 EPSPS蛋白平均表達(dá)量一般在葉片和雄穗中差異不明顯［14］。

3.2.2 快速檢測的取樣時期與部位

在確保Bt蛋白檢測靈敏度的基礎(chǔ)上，兼顧CP 4 EPSPS蛋白的檢測靈敏度。建議選擇Bt蛋白含量最高的新鮮葉片作為取樣部位。

苗期取樣Bt蛋白含量較低且制種田玉米與大田玉米非常相似很難區(qū)分，隨機抽查種子生產(chǎn)基地比較困難。乳熟期取樣Bt蛋白含量下降檢測靈敏度降低且種子即將收獲，檢測和搜集相關(guān)證據(jù)鏈必須趕在種子收購前，時間緊張。兼顧監(jiān)管工作效果和檢測靈敏度，建議選擇抽絲期前母本抽雄的時期取樣。這種選擇具備以下優(yōu)點：1）抽絲期前后Bt蛋白含量較高易檢測；2）抽絲期前母本抽雄的時期是種子企業(yè)開展田間母本去雄和種子管理部門組織花檢的重要階段，企業(yè)和管理機構(gòu)的人員方便組織和聯(lián)絡(luò)；3）距離收獲時間較長，檢測和搜集相關(guān)證據(jù)鏈的時間比較充裕。

3.3 快速檢測樣品的要求

為確保田間取樣的玉米樣品具有足夠代表性，能夠反映大田真實情況，取樣點的選擇可借鑒玉米種子田間檢驗的經(jīng)驗。兼顧檢測實際與制種田面積對樣區(qū)數(shù)目的要求，建議母本和父本各選擇5個樣區(qū)，取樣樣區(qū)隨機分布，每個樣區(qū)隨機取1株，即每個樣品母本和父本各取5株。檢測時母本和父本的每株葉片各取一部分均勻混合，制成2個混合樣品用于檢測。由于免疫學(xué)檢測方法要求被檢測的蛋白質(zhì)必須具有完整的空間結(jié)構(gòu)，抽查的樣品要盡快檢測。

3.4 快速檢測的項目

3.4.1 轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件的遺傳信息

從環(huán)境風(fēng)險評估中心轉(zhuǎn)基因 作 物 數(shù) 據(jù) 庫 （CERA，http：／／www.ceragmc.org）［5］，歐洲轉(zhuǎn)基因生物指南（http：／／www.gmocompass.org／eng／gmo／db）［6］和上海交通大學(xué)轉(zhuǎn)基因檢測數(shù)據(jù)庫（GMDD， http：／／gmdd.shgmo.org／）［7］中，檢索已知商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米的外源目的基因信息，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因玉米常用外源目的基因遺傳信息表（表1）。

3.4.2 轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件的篩查策略

表1中列出的27個玉米轉(zhuǎn)化事件中，引入抗蟲、耐除草劑抗性的轉(zhuǎn)化事件有25個。其中出現(xiàn)頻次最高的外源目的基因是Bt基因出現(xiàn)16次，Bar基因出現(xiàn)7次；CP4EPSPS基因出現(xiàn)7次；Pat基因出現(xiàn)5次。從Bt基因的類型分析，Cry1Ab出現(xiàn)頻次最高有6次；Cry3Bb1出現(xiàn)2次；Cry1Ac等其他類型各出現(xiàn)1次。由此可得出結(jié)論，利用Bt蛋白、Pat蛋白、Bar蛋白、CP 4EPSPS蛋白的組合，理論上可完成對25個轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件的篩查檢測。

3.4.3 轉(zhuǎn)基因檢測試紙條的選擇

市場上商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因檢測試紙條主要品牌有美國envirologix、美國agdia和國產(chǎn)的上海佑隆。3個品牌各有優(yōu)缺點，在轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管工作中可根據(jù)機構(gòu)硬件、人員狀況、檢測經(jīng)費、檢測任務(wù)不同選擇不同品牌。美國envirologix試紙條可檢測項目最多，如：Cry 1 Ab，Cry 1 Ac，Cry 1 F，Cry 2 A，Cry 3 Bb，Cry 34，mCry 3 A，Cry 9 C等多種Cry系列的抗蟲蛋白和Vip 3 A抗蟲蛋白，幾乎涵蓋了商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)入的所有抗蟲蛋白。此外還有Bar、Pat、CP 4 EPSPS 3種耐除草劑蛋白，因此使用該品牌試紙條可以檢出幾乎所有轉(zhuǎn)入抗蟲、耐除草劑蛋白的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米。但該試紙條的缺點是價格比較昂貴，1次反應(yīng)成本約32元，是國產(chǎn)試紙條的3倍。因此僅適用于監(jiān)管的關(guān)鍵對象、關(guān)鍵過程和關(guān)鍵節(jié)點，對于大規(guī)模篩查而言檢測成本太高。國產(chǎn)的上海佑隆試紙條可以檢測Cry 1 Ab／Cry 1 Ac，Cry 1 C，Cry 2 A等4種抗蟲蛋白和耐除草劑蛋白CP 4 EPSPS?？瓜x蛋白檢出限理論值可達(dá)1%，耐除草劑蛋白檢出限理論值可達(dá)0.2%，與美國envirologix試紙條0.1%～0.5%的檢出限理論值接近。且該試紙條的價格也比較便宜，1次反應(yīng)成本約11元。從表2中可看出，在大規(guī)模制種基地和種子生產(chǎn)基地的拉網(wǎng)式排查過程中選擇國產(chǎn)的Cry 1 Ab／Cry 1 Ac，CP 4 EPSPS和美國envirologix Pat／Bar 3個試紙條組合可以篩查20個轉(zhuǎn)化事件，占已知商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件的74%。這種檢測方案一個樣品的成本約54元，效率與成本兼顧，基本能夠滿足轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管快速檢測的需要。

表1 轉(zhuǎn)基因玉米常用外源目的基因遺傳信息

表2 常用快速檢測試紙可以檢出的轉(zhuǎn)化事件

4 結(jié) 語

2016年中共中央國務(wù)院印發(fā)的《關(guān)于落實發(fā)展新理念加快農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化 實現(xiàn)全面小康目標(biāo)的若干意見》一文中提出“加強農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)和監(jiān)管，在確保安全的基礎(chǔ)上慎重推廣”。新修訂的《種子法》也規(guī)定“轉(zhuǎn)基因品種的選育、試驗、審定和推廣應(yīng)當(dāng)進(jìn)行安全性評價，并采取嚴(yán)格安全控制措施”。轉(zhuǎn)基因玉米的全面監(jiān)管涉及到從種子試驗研究、品種審定到種子生產(chǎn)、銷售、農(nóng)產(chǎn)品加工和進(jìn)出口等諸多環(huán)節(jié)［10］。實現(xiàn)對這些環(huán)節(jié)的全面監(jiān)管，除了加大實驗室核酸檢測的力度，還要補充快速檢測手段。通過現(xiàn)場檢測第一時間獲得檢測結(jié)果，及時截斷轉(zhuǎn)基因玉米擴(kuò)散的鏈條。制定轉(zhuǎn)基因成分快速檢測策略的原則是：1）以最經(jīng)濟(jì)、高效的方法達(dá)到最佳的檢測效果；2）盡可能篩查出所有已知轉(zhuǎn)化事件［10］。利用 Cry 1 Ab／Cry 1 Ac，CP 4 EPSPS和Pat／Bar 3個試紙條組合，可以篩查20個轉(zhuǎn)化事件占已知商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件的74%，在盡可能篩查出已知商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件的同時將一個樣品的檢測成本控制在54元左右，效率與成本兼顧。同時借鑒玉米田間檢驗的工作經(jīng)驗，建議選擇玉米抽絲期前母本抽雄的時期取新鮮葉片快速檢測，對快速檢測的取樣點分布和取樣株數(shù)也做出了建議。

PCR篩查法是農(nóng)業(yè)行政主管部門轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管的檢測方法。作為補充檢測手段，利用試紙條的快速檢測方法可以科學(xué)、經(jīng)濟(jì)地篩查玉米中的轉(zhuǎn)基因成分，幫助監(jiān)管部門第一時間掌握田間制種狀況，有效擴(kuò)大了轉(zhuǎn)基因玉米安全監(jiān)管范圍，對于保障我國的食品安全、飼用安全和保護(hù)我國玉米的種質(zhì)資源都具有十分重要的意義［9］。

［1］聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織數(shù)據(jù)庫［OL］.http：／／faostat 3.fao.org／browse／Q／QC／E.

［2］中國國家統(tǒng)計局.國家統(tǒng)計局關(guān)于2015年糧食產(chǎn)量的公告［OL］.2015128.http：／／www.stats.gov.cn.

［3］James，C.2015年全球生物技術(shù)／轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢［J］.中國生物工程雜志，2016，36（4）：111.

［4］沈平，章秋艷，林友華，等.推進(jìn)我國轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化的思考［J］.中國生物工程雜志，2016，36（4）：2429.

［5］環(huán)境風(fēng)險評估中心轉(zhuǎn)基因作物數(shù)據(jù)庫［OL］.http：／／ceragmc.org／GM.CropDatabase.

［6］歐洲轉(zhuǎn)基因生物指南［OL］.http：／／www.gmocompass.org／eng／gmo／db.

［7］上海市轉(zhuǎn)基因生物安全檢測評估共享服務(wù)平臺.轉(zhuǎn)基因檢測方法數(shù)據(jù)庫［OL］.http：／／gmdd.shgmo.org.GMO Detection Method Database（GMDD）.

［8］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.進(jìn)口用作加工原料的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生 物 審 批 情 況 ［OL］.http：／／www.moa.gov.cn／ztzl／zjyqwgz／spxx／.

［9］張海波，張英，劉冰，等.玉米中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，24（12）：5763.

［10］劉冰，張英，張海波，等.大豆中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略研究［J］.大豆科學(xué)，2016，35（3）：411417.

［11］劉信，宋貴文，沈平，等.國外轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)化研究綜述［J］.農(nóng)業(yè)科技管理，2007，26（4）：37.

［12］劉金洋，江海洋，趙陽，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米轉(zhuǎn)育株Bt蛋白的表達(dá)特性分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，41（5）：725730.

［13］田曉燕，趙蕾，孫紅煒，等.轉(zhuǎn)Bt基因玉米葉片中Bt蛋白的表達(dá)和分泌研究［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44（1）：1113.

［14］江帆.復(fù)合Btcry 1 Ac和cry 1 Ie抗蟲玉米抗螟性及其在IRM中的作用［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，2015：2526.