耐旱馬鈴薯品種青薯9號(hào)不同時(shí)期葉片差異蛋白分析

張鳳軍， 葉景秀， 王燕鈞， 王 艦

（1.青海省農(nóng)林科學(xué)院， 西寧810016； 2.青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧810016；3.青海省高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧810016）

干旱是強(qiáng)烈限制作物產(chǎn)量的三大非生物因素之一，造成的損失最大，是其它逆境造成損失的總和［1］。世界上約36%的土地分布在干旱地區(qū)，占總耕地面積的42.9%，其余可耕地在作物生長(zhǎng)季節(jié)也經(jīng)常發(fā)生季節(jié)性干旱［1］。在我國(guó)尤其是干旱和半干旱地區(qū)，缺水問(wèn)題一直是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最主要因子，即使是降水較多的地區(qū)也普遍存在季節(jié)性和非周期性干旱問(wèn)題［2］。

馬鈴薯是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物，全球范圍內(nèi)普遍栽培。馬鈴薯是典型的溫帶氣候作物，對(duì)土壤干旱比較敏感。干旱嚴(yán)重影響著馬鈴薯的生產(chǎn)。因此，如何挖掘干旱、半干旱地區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)潛力，了解馬鈴薯抗旱機(jī)理及遺傳特性，培育抗旱品種成為馬鈴薯育種工作者目前急需解決的問(wèn)題［3］。

國(guó)內(nèi)外對(duì)馬鈴薯抗旱機(jī)理的研究已在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)及基因表達(dá)變化等方面進(jìn)行了大量研究［4－6］。近年來(lái)，基于固相化pH 梯度（IPG，immobilized pH gradients）雙向凝膠電泳（2－DE，2－dimemional gel electrophoresis）的蛋白質(zhì)分離技術(shù)及電噴霧質(zhì)譜（ESIMS，electrospray ionization mass spectrometry）、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOFMS，matrix assisted laser desorption ionization timeof－flight mass spectrometry）等鑒定技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用，以及蛋白質(zhì)組信息學(xué)的興起，促進(jìn)了蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展。李偉等［7］對(duì)耐旱品種在干旱脅迫下馬鈴薯莖段蛋白的雙向電泳圖譜進(jìn)行了分析，分析了127個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，其中108個(gè)表達(dá)量顯著上調(diào)，12個(gè)顯著下調(diào)，得到7個(gè)新增蛋白。章玉婷等［8］對(duì)云南地方耐旱品種在苗期進(jìn)行了相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，該研究?jī)H在馬鈴薯生長(zhǎng)的一個(gè)時(shí)期進(jìn)行了相關(guān)的研究，獲得了12個(gè)表達(dá)差異蛋白點(diǎn)，并進(jìn)行了功能分類(lèi)。

研究耐干旱脅迫馬鈴薯種質(zhì)在干旱脅迫時(shí)蛋白質(zhì)的變化，將有助于認(rèn)識(shí)干旱環(huán)境脅迫對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響、特異蛋白質(zhì)的功能及其與抗旱性的關(guān)系，從而為深入研究干旱脅迫下的基因表達(dá)變化及相關(guān)基因克隆奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法與技術(shù)，比較耐旱馬鈴薯品種青薯9號(hào)在不同生育時(shí)期葉片蛋白質(zhì)組的差異，尋找和馬鈴薯耐旱緊密相關(guān)的差異蛋白，通過(guò) MALDI／TOF／TOF－MS／MS 質(zhì)譜方法鑒定與分析，以期闡明其生物學(xué)功能，為耐旱馬鈴薯品種的培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為青薯9號(hào)，由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所選育，該品種抗旱性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，尤其在西部干旱、半干旱地區(qū)種植效益比較顯著［9］。

1.2 方 法

種薯選用青薯9號(hào)原種，大田種植，生育期不澆水，管理同大田生產(chǎn)。分別在苗期、盛花期和盛花后期09：00時(shí)取3株頂葉下完全展開(kāi)葉第4片復(fù)葉，去掉葉柄，混合各裂葉放入封口袋，置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?0］。

1.3 馬鈴薯葉片蛋白質(zhì)的提取

參照葉景秀等［11］和章玉婷等［8］的 TCA／丙酮法提取總蛋白質(zhì)。采用Bradford法［12］測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.4 雙向電泳

第一向IEF－PAGE（IEF，Isoelectric Focusing，等電聚焦），在 Bio－Rad PROTEAN IEF Cell等電聚焦儀上完成；第二向SDS－PAGE，在Bio－Rad PROTEANⅡxi Cell電泳儀上進(jìn)行。用考馬斯亮藍(lán)顯示蛋白點(diǎn)分布，臺(tái)灣力捷公司的 UMAX Power Look 2100 XL光密度掃描儀掃描獲取圖像，在獲得較好重復(fù)性的基礎(chǔ)上，用蛋白雙向電泳分析軟件（Bio－Rad PDQuest 8.0.1）分析雙向電泳結(jié)果，找出差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。

1.5 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

將差異表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，經(jīng)脫水、還原、烷基化、酶解和脫鹽等處理；用 MALDI－TOF－MS質(zhì)譜 儀 （Voyager－DESTR MALDI－TOF－MS；Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）測(cè)得肽質(zhì)量指紋譜（Peptide Mass Fingerprinting，PMF），將 PMF數(shù)據(jù)輸入Mascot、Peptldent等數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)其序列進(jìn)行同源性比對(duì)。蛋白質(zhì)功能分析在Pfam等蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行，鑒定耐旱的特異蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育時(shí)期的蛋白質(zhì)雙向電泳分析

采用pH 4－7的非線性IPG干膠條和12%SDSPAGE膠對(duì)青薯9號(hào)3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的葉片蛋白進(jìn)行IEF－SDS－PAGE分離，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，獲得了分辨率和重復(fù)性較好的2－DE圖譜。采用雙向電泳分析軟件（Bio－Rad PDQuest 8.0.1）對(duì) 3 個(gè) 時(shí) 期 的2－DE圖譜進(jìn)行分析。比較苗期和盛花期的蛋白質(zhì)組2－D圖譜，在苗期圖譜上找到表達(dá)量高于初花期1.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)共6個(gè)（蛋白編號(hào)：109，110，111，113，353，362）（圖1），在盛花期圖譜上找到表達(dá)量高于苗期1.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)共10個(gè)（蛋白編號(hào)：141，143，148，150，153，154，157，158，195，196）（圖2），其中有1個(gè)點(diǎn)在苗期沒(méi)有，為新增蛋白點(diǎn)（蛋白編號(hào)：150）；比較盛花期和盛花后期的蛋白質(zhì)組2－D圖譜，在盛花期圖譜上找到表達(dá)量高于盛花后期1.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)共11個(gè)（蛋白編號(hào)：143，144，150，151，152，154，155，156，158，159，160）（圖2），在盛花后期圖譜上找到表達(dá)量高于盛花期1.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)共4個(gè)（蛋白編號(hào)：192，193，200，366）（圖3）。

2.2 差異蛋白的 MALDI／TOF／TOF－MS／MS分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

將27個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)從雙向電泳膠上切下，進(jìn)行消化、酶解，酶解后的混合物經(jīng)MALDI－TOFTOF－MS分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定，共鑒定得到26個(gè)差異蛋白（表1）。功能分類(lèi)表明，這26個(gè)蛋白可能分別參與光合作用、能量代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、調(diào)控、抗性等生理生化過(guò)程，其中有1個(gè)蛋白為未知蛋白。

3 討 論

馬鈴薯是典型的溫帶作物，對(duì)水分虧缺較為敏感，干旱是限制馬鈴薯生長(zhǎng)和生產(chǎn)的主要限制因素［13］。在不同生育時(shí)期，馬鈴薯對(duì)水分的需求不同，現(xiàn)蕾期至盛花期是需水量最多的時(shí)期，若該時(shí)期水分供應(yīng)不足，將影響馬鈴薯的植株發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)［14－15］。因此，尋找抗旱性強(qiáng)的馬鈴薯生長(zhǎng)過(guò)程中其差異表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)了解其抗旱性有重要的意義。

圖1 青薯9號(hào)苗期2－DE圖譜

圖2 青薯9號(hào)盛花期2－DE圖譜

表1 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定檢索結(jié)果

圖3 青薯9號(hào)盛花后期2－DE圖譜

本研究中，在現(xiàn)蕾期鑒定到的6個(gè)差異蛋白的表達(dá)量與盛花期相比較高，超過(guò)盛花期的1.5倍，與光合作用、抗氧化和能量代謝有關(guān)，這6個(gè)蛋白為：ATP合成酶β亞基、核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶／加氧酶大亞基（蛋白點(diǎn)110和111鑒定為同一蛋白）、2－半胱氨酸氧化還原酶、半胱氨酸合成酶、烯醇化酶，說(shuō)明馬鈴薯植株在現(xiàn)蕾期就建立起了強(qiáng)大的光合作用和抗氧化系統(tǒng)，為植株的抗旱作用奠定基礎(chǔ)。ATP合成酶是能量代謝的關(guān)鍵酶，通過(guò)氧化與光合磷酸化反應(yīng)合成ATP進(jìn)行能量轉(zhuǎn)換［16］。ATP合成酶上的β亞基是光合磷酸化的催化中心，是合成ATP的關(guān)鍵所在。ATP合成酶β亞基的增量表達(dá)，能夠抵御逆境的危害［17］。核酮糖－1，5－二 磷 酸 羧 化 酶／加 氧 酶 （ribulose－1，5－bisphosphate carboxylase／oxygenase，Rubisco）是植物光合作用過(guò)程中固定CO2的關(guān)鍵酶，對(duì)光合作用的效率起 關(guān) 鍵 作 用［18］。2－半 胱 氨 酸 氧 化 還 原 酶 （2－Cys peroxiredoxin，2－CP）是普遍存在于植物體內(nèi)的一種抗氧化物酶，是植物清除活性氧的關(guān)鍵酶之一。2－CP的作用機(jī)制是將2個(gè)高度保守的半胱氨酸通過(guò)內(nèi)部或分子間二硫鍵的再生，使得2－半胱氨酸氧化還原酶具有催化活性，將H2O2分解，進(jìn)而不能產(chǎn)生活性氧［19］。相關(guān)研究表明，增強(qiáng)植物抗逆性的途徑之一是提高植物體內(nèi)抗氧化酶類(lèi)代謝的水平［20］。因此，馬鈴薯2－CP基因的增強(qiáng)其表達(dá)，對(duì)馬鈴薯抗逆性的提高有積極的意義［19］。

盛花期是馬鈴薯塊莖形成的關(guān)鍵時(shí)期，這一時(shí)期是馬鈴薯葉片的各項(xiàng)生理指標(biāo)處于非?；钴S的時(shí)期。這一時(shí)期的差異蛋白，主要與光合作用，能量物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、抗逆等有關(guān)。與光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)有：葉綠體核糖－5－磷酸異構(gòu)酶、碳酸酐酶；與能量物質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)有：NADP－蘋(píng)果酸酶、硫胺素噻唑合成酶、葉綠體錳穩(wěn)定蛋白等；與抗逆相關(guān)的蛋白質(zhì)有：NAC轉(zhuǎn)錄因子、乳酸谷胱甘肽裂解酶、吡哆醛生物合成蛋白、富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白等。盛花后期主要鑒定出4個(gè)差異蛋白，主要與光合作用和抗逆有關(guān)。鐵氧還蛋白－NADP還原酶是葉綠體中參與電子傳遞的蛋白，是一個(gè)與類(lèi)囊體膜疏松結(jié)合的可溶性鐵硫蛋白，能進(jìn)行電子氧化還原反應(yīng)，是PhotosystemⅠ的重要組成部分［21］。谷氧還蛋白在制植物的抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用，具有抗氧化、干旱以及鹽堿的作用［22］。由此可見(jiàn)，馬鈴薯在盛花期和盛花后期差異蛋白的高表達(dá)，對(duì)馬鈴薯植株穩(wěn)定的光合作用和提高自身的活性氧清除能力抗氧化作用起到很好的作用，利于馬鈴薯的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力。

綜上所述，本研究鑒定出的26個(gè)差異蛋白質(zhì)分別參與了物質(zhì)、能量代謝、光合作用、抗氧化作用等生理過(guò)程。分析表明，這些蛋白的差異表達(dá)可能與馬鈴薯品種青薯9號(hào)較強(qiáng)的抗旱性有關(guān)。本研究結(jié)果初步從蛋白質(zhì)水平解釋了馬鈴薯品種青薯9號(hào)抗旱的原因，對(duì)耐旱馬鈴薯品種的培育提供了一定的理論依據(jù)。

［1］范敏，金黎平，劉慶昌，等.馬鈴薯抗旱機(jī)理及其相關(guān)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)馬鈴薯，2006，20（2）：101－107.

［2］楊俊興，張彤，吳冬秀.磷素營(yíng)養(yǎng)對(duì)植物抗旱性的影響［J］.廣東微量元素科學(xué)，2003，12（2）：15－21.

［3］張鳳軍，阮建平，王燕鈞，等.干旱調(diào)控下馬鈴薯抗旱相關(guān)性狀的遺傳變異分析［J］.種子，2015，34（3）：20－26.

［4］賈慧，其力木格，李特日根，等.外源SNP對(duì)干旱脅迫下不同馬鈴薯品種葉片抗氧化酶活性的影響［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2016，36（3）：551－557.

［5］王燕，龔學(xué)臣，祁利潘，等.馬鈴薯葉片響應(yīng)干旱脅迫的結(jié)構(gòu)特征［C］.中國(guó)馬鈴薯大會(huì)論文集，2016，7（23）：320－326.

［6］白江平，胡開(kāi)明，高慧娟，等.馬鈴薯StSnRK 2家族轉(zhuǎn)錄表達(dá)對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)及生理指標(biāo)相關(guān)性分析［J］.植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，34（4）：602－613.

［7］李偉，王芳，王艦.干旱脅迫下馬鈴薯莖段蛋白的雙向電泳圖譜分析［J］.分子植物育種，2016，14（5）：1 217－1 222.

［8］章玉婷，周德群，蘇源，等.干早脅迫條件下馬鈴薯耐早品種寧菠182葉片蛋白質(zhì)組學(xué)分析［J］.遺傳，2013，35（5）：666－672.

［9］王艦，蔣福禎，周云，等.優(yōu)質(zhì)抗旱馬鈴薯新品種青薯9號(hào)選育及栽培要點(diǎn)［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，2009（2）：89－90.

［10］抗艷紅，龔學(xué)臣，趙海超，等.不同生育時(shí)期干旱脅迫對(duì)馬鈴薯生理生化指標(biāo)的影響［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（15）：97－101.

［11］葉景秀，陳蕊紅，張改生，等.殺雄劑SQ－1誘導(dǎo)小麥雄性不育華藥蛋白質(zhì)組分分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，17（5）：858－864.

［12］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72：248－254.

［13］Deblonde P.M.K，Haverkon A.J.，Ledent J.F..Responses of early and late potato cultivars to moderate drought conditions：Agronomic parameters and carbon isotope discrimination［J］.Eur J Agronomy，1999（11）：91－105.

［14］Belanger G.，Wslsh J.R.，Richards J.E.，et al.Tuber growth and biomass partitioning of two potato cultivars grown under different N fertilization rates with and without irrigation［J］.American Journal of Potato Research，2001，78（2）：109－117.

［15］Wu Lan，Liu Mingzhu，Liang Rui.Preparation and properties of a double－coated slow－release NPK compound fertilizer with superabsorbent and water－retention［J］.Biore－source Technology，2008，9（3）：547－554.

［16］倪張林，魏家綿.ATP合酶的結(jié)構(gòu)與催化理［J］.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2003，29（5）：367－374.

［17］沈凡瑞，張文蔚，張華崇，等.黃萎病菌侵染對(duì)感病棉花品種葉片蛋白質(zhì)組的影響［J］.棉花學(xué)報(bào)，2015，27（2）：159－165.

［18］葛喜珍，趙有璽，劉曉宇，等.生物固定CO2代謝途徑及關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展［J］.北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，27（1）：63－68.

［19］羅惠珍，鄧舒，肖蓉，等.棗樹(shù)2－半胱氨酸氧化還原酶基因Zj2－CP的生物信息學(xué)分析及表達(dá)載體的構(gòu)建［J］.分子植物育種，2015，13（7）：1 545－1 552.

［20］夏民旋，王維，袁瑞，等.超氧化物歧化酶與植物抗逆性［J］.分子植物育種，2015，13（11）：2 633－2 646.

［21］楊超，胡紅濤，吳平，等.高等植物鐵氧還蛋白－NADP＋氧化還原酶研究進(jìn)展［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（9）：1 353－1 366.

［22］李國(guó)龍，吳海霞，孫亞卿，等.甜菜葉片應(yīng)答干旱脅迫的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析［J］.作物雜志，2015（5）：63－68.