達氏鱘與中華鱘的 免疫抗病能力差異分析

胡 銀 董艦峰 楊 軍 湯 東

一、中華鱘與達氏鱘簡介

鱘形目魚類是現(xiàn)存起源最早的脊椎動物之一。達氏鱘（Acipenser dabryanus）隸屬于鱘形目，又名為沙臘子，長江鱘；為我國特有物種，主要分布于金沙江下游和長江上游。達氏鱘為淡水定居性魚類，除產(chǎn)卵之外，不定期進行洄游；達氏鱘屬于異速生長性，2-3年齡生長最快，平均體長為55.1cm；該魚的繁殖季節(jié)在4-5月，性成熟年齡：雌性為6-8年，雄性為4-5年。達氏鱘屬于廣溫性魚類，生長適宜溫度17.8-26.2℃，最適溫度是21℃。中華鱘（Acipenser sinensis）是我國一級水生野生保護動物，隸屬于鱘形目（Acipenseriformes），鱘科（Acipenseridae），鱘屬（Acipenser）。歷史上，中華鱘廣泛分布于我國黃海北部海洋至海南島萬寧縣近海，長江、珠江、閩江、甌江、錢塘江和黃河流域，在長江上游和珠江流域的西江均有產(chǎn)卵場。朝鮮西海岸和日本九州也有中華鱘捕撈記錄。目前，中華鱘在珠江、黃河及閩江已絕跡，僅分布于我國東海岸、朝鮮半島西海岸和長江流域。中華鱘為大型江海洄游性魚類。每年6-8月，成年中華鱘由東海聚集到長江口溯江洄游，翌年10-11月在上游產(chǎn)卵場繁殖。中華鱘性成熟個體于9-11月洄游至長江上游產(chǎn)卵場進行繁殖。產(chǎn)卵場環(huán)境要求高，水溫需在18.5-20.5℃。中華鱘生活周期長、性成熟遲，繁殖群體年齡雄性為9-22齡、雌性14-27齡相比之下，達氏鱘春秋兩季產(chǎn)卵，以春季為主，二者的產(chǎn)卵季節(jié)雖有重疊，但在中華鱘的產(chǎn)卵場從未捕到同時產(chǎn)卵的達氏鱘，難有混存的現(xiàn)象，因此中華鱘與達氏鱘存在生殖隔離。

二、中華鱘與達氏鱘的疾病研究進展

與其它脊椎動物類似，中華鱘與達氏鱘也有免疫系統(tǒng)。隨著漁業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖過程中達氏鱘與中華鱘也出現(xiàn)各種各樣的疾病，在前人探索疾病預防的基礎上，人們從不斷研究中認識到免疫系統(tǒng)對疾病的預防有顯著的作用。在研究達氏鱘與中華鱘疾病的歷程中，發(fā)現(xiàn)卵霉病是達氏鱘卵人工孵化過程中主要的疾病，是由同絲水霉、鞭毛綿霉等水生真菌引起的；腸炎病為達氏鱘最嚴重的原發(fā)病，死亡率較高；脹氣病的致病率為2%；在感染赤皮病圓口魚與達氏鱘套養(yǎng)試驗過程中，結(jié)果顯示1-2齡達氏鱘死亡率達25%，3-4齡達氏鱘影響有限；腐皮病對達氏鱘的感染過程中，死亡率不高；達氏鱘與圓口魚套養(yǎng)模式中，圓口魚感染小瓜蟲大量死亡，而達氏鱘至始至終安然無恙，表明了達氏鱘對小瓜蟲有較強的抵抗能力。 張德志等報道在人工養(yǎng)殖條件下，中華鱘也感染擬馬頸魚虱，其主要寄生在鱘魚的鰭基部、肛門和鰓弓，尤其是鰓弓，口腔等部位最多，寄生蟲寄生部位四周紅腫，發(fā)炎，嚴重出現(xiàn)潰爛，大量死亡；中華鱘易感染腸炎病，會引起死亡，而爛鰓病危害20cm以下的中華鱘，感染2-3天會死亡；中華鱘感染小瓜蟲之后大量死亡，說明其抵御病害能力較弱。本文就是在分子水平上，比較達氏鱘與中華鱘的抗病能力差異，為它們的疾病預防提供理論依據(jù)。

三、中華鱘與達氏鱘的抗病能力分析

鱘魚的抗病能力隨著環(huán)境的變異而發(fā)生不同的差別，不同種類的鱘魚在基因的水平上有顯著差異；張四明等采用PCR技術和DNA測序技術，測定中華鱘與達氏鱘個體間mtDNA分子的串聯(lián)重復序列單元堿基突變?yōu)?-3個；采用DNA測序技術首次測定了達氏鱘等12種鱘形目魚類的mtDNA ND4L和ND4基因（703 bp）的序列，并進行了分子系統(tǒng)學分析，認為達氏鱘與中華鱘親緣關系最近，很有可能是中華鱘的一陸封類型。中華鱘與達氏鱘間的堿基差異分別為2-3、7-8。物種堿基差異的大小與物種親緣關系成正比，堿基差異越大,物種親緣關系越遠。因此重復序列差異所提示的幾種鱘魚類的親緣關系與我們從其它基因（mtDNA ND4L和ND4）序列和隨機擴增多態(tài)性DNA得到的親緣關系結(jié)果相一致，初步說明了重復序列在鱘魚類的進化過程中扮演著一定的角色。DNA的堿基不同影響免疫基因的表達不同。

1.鱘類抗病能力的種間變異

寄主對不同病原常常會產(chǎn)生差異懸殊的反應，其自身抗病能力也會產(chǎn)生微妙的變化。各種致病原（病毒，細菌，寄生蟲等）表現(xiàn)出寄主專一性的多種變異，主要原因是，缺乏致病原和潛在宿主間不定期隨意的接觸或?qū)嶒炐越佑|，可能的變異和病原對宿主的適應尤其是某些病毒存在若干性狀上有差異的品系。而且不同種類鱘魚抗病能力有很大的差異。而達氏鱘與圓口魚套養(yǎng)模式，達氏鱘沒有感染小瓜蟲，中華鱘感染小瓜蟲大量死亡，鱘魚對寄生蟲的易感性有區(qū)別；從肝臟的免疫基因上分析，不同的免疫基因在達氏鱘與中華鱘中表達量有差異；中華鱘是過河口洄游性魚類，達氏鱘是淡水定居性魚類，生活習性的不同對于免疫基因的表達也有一定的影響。魚類是變溫動物，隨著環(huán)境的變化，鱘魚體溫會發(fā)生變化，郭文獻等據(jù)1959-2006年水庫下游宜昌水文站實測水溫資料，分析了宜昌江段水溫特征參數(shù)變化情況，他指出，葛洲壩水庫蓄水對下泄水溫影響不大，而三峽水庫蓄水后，水溫在降溫季節(jié)高于三峽水庫蓄水前表層水溫，而在升溫季節(jié)3-5月則相反；中華鱘定期洄游產(chǎn)卵，體溫變化幅度較大，達氏鱘體溫的變化幅度較小，從而影響超氧化物岐化酶的活性，當受到病毒、細菌入侵時，機體的免疫細胞會產(chǎn)生自由基物質(zhì)（主要是氧自由基和一氧化氮自由基等）來殺滅細菌病毒，這是免疫反應中重要的一環(huán)，免疫基因的表達量受到了嚴重的影響，減弱鱘魚的抗病效果。魚類具有不同的免疫臨界溫度，這可能與魚類的生活習性有關，一般來說溫水性魚類較高，冷水性魚類較低。一般認為，在免疫臨界溫度以上，魚類免疫應答的強度隨溫度的升高而增強。魚體的免疫基因MHC2主要在免疫系統(tǒng)的細胞上表達，Sultmann等研究斑馬魚MHC2類A基因的多態(tài)性、功能表達中，發(fā)現(xiàn)MHC2類A基因在脾臟中高度表達；達氏鱘與中華鱘的MHC2基因相似率為99.5%，但基因的表達量造成達氏鱘與中華鱘的抗病能力的差異；其次基因的表達編碼的蛋白質(zhì)也有較少的差別，MHC2基因表現(xiàn)的生物活性有區(qū)別。鱘魚的種間變異也是外部環(huán)境造成的，隨著時間的推移，鱘類部分脾臟不斷進化，達氏鱘的種屬發(fā)生進化，免疫功能趨于完善，表現(xiàn)出比中華鱘的抗病能力要強。本實驗發(fā)現(xiàn)達氏鱘與中華鱘免疫基因的相似率比較高，但是中華鱘溫差變化幅度大，在感染外來病原體時，免疫系統(tǒng)迅速作出免疫應答，溫度影響酶的活性，促使基因表達mRNA量降低，抵御病害有一定的限度，因此中華鱘的病害迅速暴發(fā)。免疫基因表達的mRNA量與生物體抵御病害能力成正相關。中華鱘與達氏鱘是同一物種進化的分支，種群內(nèi)發(fā)生了變異，從而表現(xiàn)出免疫抗病能力的區(qū)別。

2.鱘魚群體之間的遺傳變異

鱘魚終生生活在水環(huán)境中，所以水環(huán)境中的鱘魚會面臨多種病害的威脅。鱘魚不同群體生物抗病能力不同，一定程度上取決于群體的遺傳變異。達氏鱘久居淡水水域中，而且不斷與環(huán)境抗爭，春秋兩季都產(chǎn)卵，以春季為主，產(chǎn)卵量較大，后代存活率較高，經(jīng)過環(huán)境的選擇，后代的遺傳變異幾率大；相比之下中華鱘秋季產(chǎn)卵，沒有春季產(chǎn)卵的實例，而存活的后代數(shù)量有限，后代的遺傳變異幾率小，故而抗病能力顯著下降。除了選擇的遺傳影響外，在遺傳表型中還摻雜著顯性及母體遺傳反應，達氏鱘的免疫基因呈現(xiàn)母系遺傳，經(jīng)過后代的不斷遺傳變異，后代免疫基因的突變幾率較高；表現(xiàn)出抗病能力較強。Tang等（1992）將含生長激素基因的質(zhì)粒導入小鼠表皮細胞，88%的被免疫小鼠產(chǎn)生了抗生長激素抗體，二次免疫后抗體水平顯著升高?，F(xiàn)在用很多病原體抗原基因的重組質(zhì)粒接種動物，均引發(fā)了特異性的免疫應答，并對野毒攻擊具有一定的保護作用。隨著免疫基因的分析應用不斷深入，基因免疫應用得到了廣泛的應用。中華鱘天然群體遺傳多樣性偏低，但不同年度群體間遺傳差異不明顯，年度間樣本遺傳穩(wěn)定。截流后中華鱘遺傳多樣性有微弱的下降，但依然能夠維持群體的遺傳多樣性水平。曹波通過RAPD研究野生、人工養(yǎng)殖中華鱘的遺傳多樣性，野生與養(yǎng)殖群體的多態(tài)位點的比例為43.16%和33.68%，野生中華鱘群體間平均遺傳距離為0.127，遺傳相似率87.3%，人工養(yǎng)殖品種在遺傳上有一定退化，養(yǎng)殖群體已經(jīng)對野生群體造成了影響。而Wan Qiuhong等通過 DNA指紋技術，測定了1958-1959年、1980-1981年和1998-1999年達氏鱘的DNA條帶數(shù)（19、19、18）、特有條帶率（25.4%、12.9%、10.6%）和不同條帶數(shù)（63、54、47），發(fā)現(xiàn)達氏鱘的DNA多樣性有丟失的傾向，水平最低。天然中華鱘與達氏鱘懷卵量不同，而且后期人類大量破壞生態(tài)水環(huán)境，造成中華鱘的性腺發(fā)育成熟緩慢，中華鱘的數(shù)量急劇下降，造成群體的遺傳多樣性降低，會影響到后代的免疫基因的遺傳多樣性降低。達氏鱘性成熟早，懷卵量豐富，后代存活比例較高，種群間遺傳多樣性高，特別西南地區(qū)的水溫適宜，餌料資源豐富，適合達氏鱘的生長，達氏鱘免疫基因的遺傳多樣性高。2011年研究人員放養(yǎng)達氏鱘550條，用PIT芯片標記達氏鱘，保護區(qū)內(nèi)資源調(diào)查區(qū)都檢測到標記放流的達氏鱘。達氏鱘在自然生態(tài)下后代抵御病害的能力較強，則說明免疫基因的表達量與多樣性較中華鱘高，從而說明了達氏鱘比中華鱘的免疫抗病能力強。

四、結(jié)論

通過在分子水平上分析中華鱘與達氏鱘之間的區(qū)別，來深入探究它們抗病能力的差別，結(jié)合中華鱘與達氏鱘的進化親緣關系，分析中華鱘與達氏鱘的現(xiàn)狀，可以獲得結(jié)論：免疫基因的表達量變化以及遺傳多樣性影響免疫應答反應過程，與其發(fā)揮免疫抗病能力的強弱息息相關。