甜菜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究進(jìn)展

鄒 奕 ，吳則東 ，3，興 旺 ，3，邳 植 ，崔 平 *

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

甜菜分為野生種和栽培種，栽培種又分為4個(gè)變種：葉用甜菜、糖用甜菜、食用甜菜和飼用甜菜。甜菜分為3個(gè)亞種，其中有兩個(gè)是野生亞種，而全部的栽培種屬于Beta vulgaris subsp.vulgaris亞種[1-2]。我國甜菜品種主要來自法國、丹麥、德國、美國等國家，有的甜菜品種直接應(yīng)用到生產(chǎn)中，有的品種作為父母本材料應(yīng)用到培育甜菜新品種（系）中。種質(zhì)資源的遺傳多樣性是育種的基礎(chǔ)也是引種栽培和資源保護(hù)的基礎(chǔ)，遺傳多樣性研究對于選擇具有較強(qiáng)組合能力的親本是非常重要的，在雜交時(shí)，可以增加獲得優(yōu)良基因型的機(jī)會(huì)；植物材料的遺傳多樣性評價(jià)是鑒定、保存遺傳資源和設(shè)計(jì)育種方案的第一步[3]。甜菜屬藜科甜菜屬，是世界上最重要的糖料作物之一。研究甜菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，能夠幫助我們分析種質(zhì)間親緣關(guān)系的遺傳組成，對拓展甜菜種質(zhì)基礎(chǔ)、發(fā)掘和利用優(yōu)質(zhì)基因進(jìn)行新品種培育具有重要意義。

1 甜菜的遺傳多樣性研究

遺傳多樣性通常指物種內(nèi)不同種群之間或種群內(nèi)個(gè)體間的遺傳變異。遺傳多樣性的表現(xiàn)是多層次的，表現(xiàn)出個(gè)體水平、細(xì)胞水平、染色體結(jié)構(gòu)及功能的多樣性。在分子水平上，其特征在于生物大分子的多樣性，例如核酸、蛋白質(zhì)和多糖。生物的進(jìn)化造成生物分布與適應(yīng)性差異，遺傳表達(dá)為遺傳多樣性。目前，我們主要從形態(tài)學(xué)水平，細(xì)胞學(xué)水平，生化水平和分子水平研究遺傳多樣性[4]。

1.1 形態(tài)學(xué)水平

形態(tài)標(biāo)記是在植物生長發(fā)育期間可看到的形態(tài)特征，是顯示遺傳多態(tài)性的外觀特征。

興旺等[5-6]研究了來自不同國家甜菜種質(zhì)資源的不同形態(tài)形狀的遺傳多樣性。結(jié)果表明，不同國家的種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，充分了解了甜菜種質(zhì)資源葉部性狀遺傳多樣性地理分布特點(diǎn)和種質(zhì)資源種群間的遺傳關(guān)系，對于鑒別特異種質(zhì)，挖掘優(yōu)異種質(zhì)材料具有現(xiàn)實(shí)意義，并篩選出了部分可用于育種的優(yōu)質(zhì)親本。趙尚敏等[7]采取聚類分析的方法對甜菜抗叢根病種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性劃分，對形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析后，將59份甜菜種質(zhì)資源材料分為六大類，供試材料表型遺傳上存在較大差異，為育種選種提供了有價(jià)值的信息。M Saccomani等[8]對18個(gè)甜菜基因型研究發(fā)現(xiàn)根長、根表面、根頭量、葡萄糖和果糖含量有顯著的遺傳差異，這些性狀與根產(chǎn)和產(chǎn)糖量顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明根形態(tài)、生理性狀與其生產(chǎn)力的關(guān)系存在密切關(guān)聯(lián)。這些在整個(gè)根系層面的協(xié)調(diào)行動(dòng)有助于解釋植物如何適應(yīng)多種環(huán)境壓力。Stevanato等[9]通過根系性狀的評估探索亞得里亞海沿岸甜菜種質(zhì)遺傳多樣性，在具有理想根性狀的甜菜種質(zhì)中，有4份材料（B.vulgaris L.ssp.vulgaris）對營養(yǎng)脅迫有高耐受性。植物育種中形態(tài)標(biāo)記雖相對直觀，但無法準(zhǔn)確地了解種群的遺傳變異[10]。

1.2 細(xì)胞學(xué)水平

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記即植物細(xì)胞染色體的變異。包括染色體核型和帶型的變化[11]。利用細(xì)胞學(xué)標(biāo)記研究甜菜遺傳多樣性的研究在上世紀(jì)60~80年代較多，近年來比較少。王華忠等[12]研究單胚甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)上存在較大差異，將敗育初期確定在四分體時(shí)期的絨氈層細(xì)胞與中層脫離開始,與以往的研究者認(rèn)為敗育初期在四分體時(shí)期以后的看法有所不同。

1.3 生化水平

生化標(biāo)記主要包括貯藏蛋白和同工酶標(biāo)記，它們是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)多樣性可間接反映生物DNA組成和生物遺傳的差異與多樣性。它打破了形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記直接使用整個(gè)樣本作為研究材料的方式，并且?guī)缀醪灰蕾囉诃h(huán)境[13]。但是生化標(biāo)記在甜菜中的應(yīng)用也不多。

張輝等[14]分析了航天衛(wèi)星搭載的葉叢快速增長期的一年生 SP3、盛花期和抽薹期的二年生SP3甜菜的SOD、CAT、POD酶活性及同工酶譜。結(jié)果表明，各品系變異程度不同，二倍體材料的變異率明顯高于四倍體和單胚材料。H Wagner等[15]也利用甜菜的同工酶標(biāo)記與形態(tài)標(biāo)記的連鎖關(guān)系來評估材料之間的遺傳關(guān)系。

1.4 DNA水平

分子標(biāo)記指能反映個(gè)體或種群基因組中某種差異的DNA片段，直接反映基因組DNA之間的差異[7]。遺傳多樣性和種質(zhì)結(jié)構(gòu)的評估對于有效組織育種材料以及利用遺傳資源改良作物是必不可少的[16]。分子標(biāo)記反映了DNA水平上基因型之間存在的實(shí)際遺傳變異水平，并因此提供了比表型和譜系信息更準(zhǔn)確的評價(jià)。

1.4.1 RAPD標(biāo)記技術(shù) RAPD技術(shù)可以在DNA分子水平上檢測全基因組多態(tài)性，無需任何分子生物學(xué)研究，為確定品種和品系之間的遺傳關(guān)系提供統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)植物的遺傳多樣性研究，并在甜菜研究中發(fā)揮了一定的作用[17-18]。

張子義等[17]和張福順等[18]利用RAPD技術(shù)對不同甜菜品種進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明甜菜的遺傳資源較為豐富，且不同國家的品種親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，應(yīng)加強(qiáng)種質(zhì)收集，為雜交育種創(chuàng)造有利條件。Shen等[19]首次采用RAPD技術(shù)對一年生野生甜菜的遺傳多樣性進(jìn)行檢測并對其間的親緣關(guān)系進(jìn)行了劃分。Saclain等[20]用6個(gè)RAPD隨機(jī)引物探究了11個(gè)甜菜品種的遺傳變異和親緣關(guān)系，共擴(kuò)增63個(gè)DNA片段，其中43個(gè)（68.25%）有多態(tài)性，遺傳變異較遠(yuǎn)的相關(guān)品種可以選擇用于將來的育種計(jì)劃。V Izzatullayeva等[21]使用RAPD比較分析42個(gè)甜菜種質(zhì)的遺傳變異。共使用24個(gè)多態(tài)性引物（12個(gè)RAPD和12個(gè)ISSR）。RAPD引物產(chǎn)生204個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，ISSR引物產(chǎn)生178個(gè)擴(kuò)增片段，其中190個(gè)和173個(gè)分別為多態(tài)性引物。ISSR標(biāo)記的平均多態(tài)性水平（97.2%）高于RAPD引物（93.0%）。類似的研究還有很多，這些研究充分地證明了RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在檢測遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析中是很有潛力的。

1.4.2 SSR標(biāo)記技術(shù) 由于其遺傳共顯性和技術(shù)簡單的特點(diǎn)，SSR技術(shù)被廣泛用于甜菜遺傳多樣性的分析，并且是目前最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一。

王華忠等[22]結(jié)合SRAP和SSR兩種分子標(biāo)記，分析了甜菜單胚雄性不育系及保持系的遺傳多樣性。結(jié)果表明，不同甜菜品種的異質(zhì)性較高，國內(nèi)外材料的遺傳基礎(chǔ)不同。然而，用于生產(chǎn)的甜菜品種具有較近的親緣關(guān)系和較窄的遺傳基礎(chǔ)。楊文柱[23]優(yōu)化了甜菜分子標(biāo)記技術(shù)體系，通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)57種甜菜試驗(yàn)材料具有豐富的遺傳多樣性。 根據(jù)引物檢測到的甜菜材料的遺傳多樣性圖譜將57種甜菜材料聚成兩類。 第一類是與抗病性密切相關(guān)的基因型材料，第二類是與含糖和產(chǎn)量密切相關(guān)的基因型材料。P.Stevanato等[9]用44個(gè)多態(tài)等位基因的21個(gè)SSR標(biāo)記對亞得里亞海沿岸的39種沿海甜菜遺傳多樣性進(jìn)行了評價(jià)，沿海甜菜主要分成兩個(gè)類群：西部和東亞得里亞海沿岸群，后者表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。JLi等[24]用23個(gè)SSR標(biāo)記對來自種子和花粉親本雜種優(yōu)勢基因庫的111和178個(gè)自交系進(jìn)行了基因分型，在整個(gè)種質(zhì)中檢測到兩個(gè)不同的亞組。Ta?ki-Ajdukovic K等[25]用26個(gè)SSR引物對來自12個(gè)二倍體甜菜授粉者（花粉親本）和兩個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（CMS）共140個(gè)個(gè)體樣本的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果：共獲得129個(gè)等位基因，每個(gè)SSR平均3.2個(gè)等位基因，雜合度為0.00～0.87（平均0.30），77.34%的總遺傳變異歸因于群體內(nèi)的變異。該方法可提高授粉系作為合適親本的選擇效率。SSrivastava等[26]用14個(gè)含二核苷酸的SSR引物擴(kuò)增了13個(gè)基因型的基因組DNA，獲得243個(gè)擴(kuò)增子，屬于88個(gè)等位基因，分子量為124~1222 bp，平均為17.36個(gè)擴(kuò)增子/引物，多態(tài)信息含量（PIC）=0.625～0.851。UPGMA樹狀圖將這些基因型分類兩個(gè)主要群、共5個(gè)叢。共表型系數(shù)（r=0.96）證明這些SSR標(biāo)記能有效地分析甜菜基因型間的遺傳關(guān)系。

1.4.3 SRAP標(biāo)記技術(shù) 序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性 （SRAP）技術(shù)是一種基于PCR擴(kuò)增技術(shù)的新型高效PCR技術(shù)。SRAP標(biāo)記技術(shù)也發(fā)展得比較成熟，我國學(xué)者在甜菜上的應(yīng)用報(bào)道較多，如張輝[14]、王華忠[22]、李博[27]。王茂芊等[28-30]利用SRAP對東北、華北、西北地區(qū)的甜菜品系進(jìn)行了遺傳多樣性研究。王茂芊等[31-32]用SRAP引物組合進(jìn)一步鑒定分析了11份抗根腐病的優(yōu)良甜菜品種和25份抗褐斑病性較好的甜菜品種，結(jié)果表明，平均多態(tài)性比分別為76.5%和64.4%，遺傳距離分別為0.5057和0.4670，遺傳相似系數(shù)分別為0.6031和0.6269，兩種材料的聚類分析均分為3個(gè)類群。Nagl N等[33]介紹了開發(fā)快速和廉價(jià)的RAPD和SRAP標(biāo)記方法的結(jié)果，并討論了它們在鑒定與抗甜菜胞囊線蟲抗性基因相關(guān)標(biāo)記方面的潛在用途。

1.4.4 ISSR標(biāo)記技術(shù) ISSR標(biāo)記技術(shù)試驗(yàn)操作簡單、快速、高效，重復(fù)序列和錨定堿基的選擇是隨機(jī)的，無需繁瑣地構(gòu)建基因文庫、雜交和同位素顯示等程序，無需掌握靶標(biāo)序列的背景信息，無需活材料和無組織器官特異性，從而降低了技術(shù)難度和實(shí)驗(yàn)成本，能實(shí)現(xiàn)全基因組無編碼取樣[34]。

劉華君等、傅增娟等、劉巧紅等使用ISSR標(biāo)記進(jìn)行甜菜遺傳多樣性評價(jià)研究[35]，其中，20份德國和瑞士的甜菜種質(zhì)資源中，獲得30條多態(tài)性條帶，遺傳相似系數(shù)為0.4615～0.9231，引物的多態(tài)信息含量（PIC）為0.6273～0.8360；僅利用1條ISSR引物，鑒定了33個(gè)甜菜種質(zhì)資源中的10份；用兩個(gè)ISSR引物，鑒定了10份來源不同的甜菜品種。H Keykhosravi[3]采用20個(gè)ISSR引物研究了甜菜20個(gè)世代的遺傳多樣性。結(jié)果表明，基因型UBC 853的PIC最高（0.38）、UBC 847的最低（0.13）；UBC 830位點(diǎn)的物種多樣性指數(shù)最高(4.32)、UBC 847的最低 （0.58）。聚類分析將甜菜基因型劃分為4個(gè)主要類群。前3個(gè)主成分分別為總變異的72.67%、5.99%和4.05%，3個(gè)主成分占總變異的82.72%，表明ISSR標(biāo)記在全基因組中分布良好。基于第一主成分的甜菜基因型分類具有相似性和差異性。本研究結(jié)果可用于甜菜育種計(jì)劃。

Izzatullayeva V等[21]發(fā)現(xiàn)ISSR引物比RAPD更適合甜菜的遺傳多樣性分析。Srivastava S等[36]使用28個(gè)RAPD和4個(gè)ISSR引物進(jìn)行分析，獲得具有162~2862 bp的327個(gè)RAPD標(biāo)記（11.67/引物）和160~1884 bp的39個(gè)ISSR標(biāo)記 （9.75/引物）的高度多態(tài)性條帶。RAPD和ISSR引物PIC的平均值分別為0.41和0.44。RAPD與ISSR遺傳相似度間存在顯著相關(guān)性 （r=0.908），但同工酶與RAPD和ISSR的相關(guān)性較低?；赗APD（0.27）和ISSR（0.35）的平均遺傳相似性比同工酶（0.726）低得多，說明基于DNA的標(biāo)記具有檢測群體中高度多態(tài)性的能力。A Litwiniec等[37]采用RAPD、ISSR分子標(biāo)記技術(shù)評價(jià)野生甜菜和栽培甜菜尤其是Beta vulgaris遺傳多樣性的程度，目的是確定在叢根病環(huán)境抗性背景下，在不同材料群中所選擇的分子標(biāo)記的潛在有用性和一致性。結(jié)果表明，栽培型品種間群體分化值和距離值相對高于野生型。此外，品種多樣性成分在種群水平受影響高于總體水平。研究結(jié)果揭示了栽培種上存在的預(yù)期遺傳瓶頸，與野生抗病源相比，現(xiàn)代品種叢根病抗性的遺傳決定因素之間存在顯著性差異。

1.4.5 SNP標(biāo)記技術(shù) 目前單核苷酸多態(tài)性（SNP）在甜菜上的應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展空間。Simko I等[38]采用702個(gè)多樣性陣列技術(shù) （DArT）、34個(gè)SNP和30個(gè)SSR標(biāo)記對5個(gè)種子公司的54份二倍體甜菜（Beta vulgaris L.ssp.vulgaris）雜交種進(jìn)行基因分型。對SSR和SNP數(shù)據(jù)集的分析表明，部分雜交品種有共同的（或非常密切的）親本。3個(gè)標(biāo)記系統(tǒng)的比較顯示，分析所需的位點(diǎn)數(shù)目有很大的差異。品種聚類要求基因型多樣性檢測所需的SSR標(biāo)記為1.8～2×SSR，3～4.5×SNP，為4.8×DArT標(biāo)記。不同標(biāo)記系統(tǒng)的位點(diǎn)成功率，SSR標(biāo)記最高，DArT標(biāo)記最低。一般需要1.4~3×SNP，4.9~13.3×SSR，才能達(dá)到100%的成功率。然而，僅使用多態(tài)性較高的DArT標(biāo)記，可使分析所需的DArT位點(diǎn)數(shù)減少38%～61%。B Mangin等[39]用320和769個(gè)SNP分析了2035份世界甜菜種質(zhì)和1338份甜菜優(yōu)良品系的遺傳關(guān)系和連鎖不平衡，用4種不同的方法對種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。在世界種組中，有3種方法給出了非常一致的種群結(jié)構(gòu)圖。飼用甜菜和糖甜菜被分為一組，從觀賞甜菜和沿海甜菜中分離出來，很好地反映了甜菜馴化的起源。然而，聚類優(yōu)良品系組結(jié)構(gòu)不太穩(wěn)定，可能是育種中基因高度混合所致。種群變化進(jìn)程和交配系統(tǒng)被認(rèn)為是影響植物種內(nèi)遺傳多樣性的主要因素。PTouzet等[40]對地理分布和交配系統(tǒng)不同的Beta macrocarpa、Beta patula、Beta vulgaris maritima和B.v.adanensis進(jìn)行了葉綠體和核序列的核苷酸多樣性研究。通過系統(tǒng)發(fā)育和多元分析來評估它們之間的遺傳關(guān)系，將它們的遺傳多樣性與其交配系統(tǒng)聯(lián)系起來，Beta macrocarpa主要為二倍體，但在加那利群島和葡萄牙卻為四倍體，因此要重新考慮它們的倍性狀況和加那利群島的Beta macrocarpa起源。

1.4.6 其他標(biāo)記技術(shù) 其他主要的分子標(biāo)記目前也已被應(yīng)用到甜菜研究中。孟祥雯等[41]用cDNA-AFLP分子標(biāo)記對不育系及保持系甜菜花蕾進(jìn)行基因多態(tài)性分析，經(jīng)篩選、驗(yàn)證后得到4個(gè)陽性差異片段。這些片段可作為甜菜Owen型不育系及保持系快速鑒定的依據(jù)，對縮短甜菜育種年限，加快育種進(jìn)程具有重要意義。

2 甜菜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究方向的展望

甜菜遺傳多樣性研究方法發(fā)展歷程表明，DNA水平的分子標(biāo)記技術(shù)具有準(zhǔn)確、高效、成本低的優(yōu)點(diǎn)，目前已逐漸變?yōu)橹髁?。而在眾多分子?biāo)記技術(shù)中，RAPD、SSR、ISSR、SRAP等技術(shù)目前已非常常用且成熟。在甜菜的研究中，SSR標(biāo)記仍是目前的主流，但應(yīng)認(rèn)識到，SNP標(biāo)記具有全基因組覆蓋、高通量、位點(diǎn)特異等SSR不具有的優(yōu)點(diǎn)且成本正在降低，因此我們應(yīng)重視SNP標(biāo)記[42]。同時(shí)，現(xiàn)在有越來越多的作物的全基因組測序已經(jīng)完成，并且高通量重測序技術(shù)也日益普及，我們也應(yīng)在全基因組學(xué)的水平開展對甜菜的遺傳多樣性的研究，這方面的技術(shù)在國外已相當(dāng)成熟，值得我們借鑒，如Jessen V[43]等人就利用了基因組組裝技術(shù)分析了栽培木薯之間的關(guān)系。我們應(yīng)在積極運(yùn)用新技術(shù)的基礎(chǔ)上更好地開展甜菜種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究。