幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性檢測研究進(jìn)展

胡美蓮，高 陽，李曉露，王麗波

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 小兒消化科，吉林 長春130000)

幽門螺桿菌胃炎(Helicobacter Pylori,Hp)是一種感染性疾病，它與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤(MALT)等多種疾病密切相關(guān)，根治Hp對上述疾病的預(yù)防及治療非常重要。Hp在人群中的感染率高，我國近一半人口存在Hp感染，隨著Hp耐藥現(xiàn)象的日趨嚴(yán)重，其根除率正在逐年下降。在臨床根治Hp方案中，克拉霉素是最常用的抗生素之一，最新報(bào)道指出Hp對克拉霉素的耐藥率已達(dá)20%-50%[1]。目前一致觀點(diǎn)認(rèn)為，Hp對克拉霉素的耐藥機(jī)制主要是Hp 23S rRNA V區(qū)基因突變，從而導(dǎo)致克拉霉素與Hp結(jié)合力下降，無法阻止蛋白質(zhì)的合成，其中A2142G和A2143G及A2142C為主要突變位點(diǎn)。多數(shù)文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，初次治療失敗將會(huì)導(dǎo)致再次治療耐藥率的升高，在初次治療之前行耐藥性檢測會(huì)提高Hp根除率，且優(yōu)于二線治療及補(bǔ)救治療。下面我們以克拉霉素為例，著重研究Hp耐藥性檢測方法，探討快速、敏感的分子生物學(xué)新技術(shù)，從而有效指導(dǎo)臨床用藥。

1 傳統(tǒng)檢測方法

即先培養(yǎng)Hp菌株，再對其進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)(包括紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、E-test試驗(yàn))，此方法被認(rèn)為是檢測Hp對克拉霉素耐藥性的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是，由于Hp在體外培養(yǎng)困難、培養(yǎng)周期長、費(fèi)用昂貴、對操作技術(shù)要求高，且不能檢測Hp耐藥突變位點(diǎn)，故不適合開展臨床檢驗(yàn)診斷。

2 分子生物學(xué)檢測方法

2.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度分析技術(shù)(PCR-RFLP):原理是利用PCR技術(shù)，對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，再利用特異性限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得到的酶切產(chǎn)物行電泳遷移率變動(dòng)分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)基因電泳圖譜對比，從而檢測有無變異。該方法受到很多學(xué)者的青睞，他們研究發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)A2142G、A2143G能分別產(chǎn)生BbsI(MboII)、BsaI 酶切位點(diǎn)。Khashei等成功應(yīng)用該技術(shù)在20株耐克拉霉素菌株中，分別檢測出18株A2142G(90%)和2株A2143G(10%)位點(diǎn)突變[2]。而Zahra等的試驗(yàn)揭示了在伊朗北部Hp對克拉霉素的耐藥率達(dá)5.6%(5/89)，且5株耐藥菌株全部為A2143G位點(diǎn)突變[3]。Pourakbari等在胃粘膜中直接取樣，利用PCR-RFLP技術(shù)分析A2142G、A2143G位點(diǎn)突變，提示有17株(50%)發(fā)生A2143G位點(diǎn)突變，10株(29%)發(fā)生A2142G位點(diǎn)突變，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，相比體外培養(yǎng)方法，明顯節(jié)省了時(shí)間[4]。Gehlot等納入68名患有消化道疾病的患者，并應(yīng)用該技術(shù)及DNA測序證實(shí)，有8株耐藥菌株，其中7株(87.5%)發(fā)生A2143G位點(diǎn)突變，該結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致，表明該技術(shù)特異度和敏感度高，可用來檢測Hp耐藥[5]。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR):原理是在PCR擴(kuò)增時(shí)同時(shí)加入引物和熒光集團(tuán)，利用熒光信號(hào)對PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值(即擴(kuò)增循環(huán)次數(shù))和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，故可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定性及定量分析。Djennanehadibi等在RT-PCR技術(shù)中加入特異性物質(zhì)Scorpion primer，并對阿爾及爾地區(qū)Hp行耐藥性分析，結(jié)果提示該地區(qū)Hp對克拉霉素的耐藥率為35%(32/91)，其中，81%(26/32)發(fā)生A2143G位點(diǎn)突變[6]。同樣，在Ducournau 等的大樣本試驗(yàn)中，利用RT-PCR方法檢測到法國地區(qū)Hp對克拉霉素的耐藥率為37.9%，該比例略高于藥物敏感試驗(yàn)(37.7%)，并指出A2142/2143G為主要突變位點(diǎn)[7]。伊朗學(xué)者Hakemi等通過RT-PCR技術(shù)直接檢測胃粘膜標(biāo)本，成功擴(kuò)增20株Hp陽性菌株，其中4株發(fā)生耐藥突變，解鏈溫度全部為54.7℃，證實(shí)發(fā)生A2143G位點(diǎn)突變[8]。Xiong等的文章表明RT-PCR檢測克拉霉素耐藥性具有完美的特異度(100%)及相對較低的敏感度，異質(zhì)性耐藥可能是導(dǎo)致低敏感度的原因，當(dāng)野生菌株與突變菌株的比值為10∶1時(shí)，可能會(huì)降低突變菌株的實(shí)時(shí)PCR檢出率[9]。值得注意的是，該技術(shù)操作簡單、專一、靈敏，較常規(guī)PCR具有更高的特異度和敏感度，除此之外，還可用于大量樣本檢測。

近年來，RT-PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛且成功的應(yīng)用于不同實(shí)驗(yàn)室，其不僅可檢測胃粘膜標(biāo)本，還可以檢測糞便標(biāo)本Hp 23S rRNA突變位點(diǎn)。Bakri收集了100例患者的糞便標(biāo)本，并利用巢式RT-PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該方法的敏感度、特異度以及準(zhǔn)確度分別達(dá)93%、100%、95%[10]。Redondo等利用巢式RT-PCR技術(shù)在Hp感染者的糞便標(biāo)本中成功檢測出A2142G和A2143G位點(diǎn)突變，其結(jié)果與胃粘膜標(biāo)本培養(yǎng)-藥敏試驗(yàn)的結(jié)果有95%的一致性[11]。RT-PCR技術(shù)檢測糞便標(biāo)本Hp 23S rRNA突變位點(diǎn),具有取材方便、無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、敏感等優(yōu)點(diǎn)，但需要解決糞便中膽鹽、重金屬離子、多糖等物質(zhì)對PCR的抑制，否則易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

2.3PCR線性探針分析(LiPA):原理是先用生物素來標(biāo)記引物，然后利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因序列，獲得生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物(即得到探針標(biāo)記的待測核酸)，再與固定在NC膜上未標(biāo)記的特殊寡聚核苷酸探針雜交，最后經(jīng)放射自顯影手段就可以判定膜上是否有互補(bǔ)的核酸分子存在。Cerqueira等將該方法用于檢測石蠟包埋的胃粘膜標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行回顧性分析及前瞻性研究，結(jié)果顯示在回顧性分析中該方法檢測Hp對克拉霉素耐藥性的敏感度和特異度分別為84.2%、90.9%，同樣，在前瞻性研究中也獲得較高的敏感度(80.0%)和特異度(93.8%)，表明PCR-LiPA技術(shù)對于檢測大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性有很高的可信度[12]。此方法不但準(zhǔn)確、靈敏，而且能同時(shí)檢測多位點(diǎn)的突變，尤其存在多重耐藥的情況下，其敏感度和特異度仍很高。但受探針的限制，目前該方法僅能檢測到7種突變基因，相信隨著技術(shù)的發(fā)展，在不久的將來我們能檢測到更多突變類型。

2.43’-錯(cuò)配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(3’-mismatchPCR)：原理是在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，使用特異性引物(如Cla18,Cla3)，由于3’末端錯(cuò)配導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物減少，產(chǎn)生片段基因，從而區(qū)分突變型與野生型。上述幾種分子生物學(xué)技術(shù)主要用來檢測Hp 23S rRNA 2142/2143位點(diǎn)A-G基因突變，然而，有文獻(xiàn)報(bào)道在一些地區(qū)A2142C也是比較常見的突變類型，選擇3’-mismatch PCR技術(shù)可以對A2142C位點(diǎn)突變進(jìn)行特異性檢測。伊朗學(xué)者Abdollahi等運(yùn)用此方法成功檢測出胃粘膜Hp 23S rRNA A2142C位點(diǎn)突變[13]。在Xuan等的文章中指出，學(xué)者Elviss等改進(jìn)3’-mismatch PCR技術(shù)后可同時(shí)檢測出A-G/C突變位點(diǎn)及野生菌株同位基因，并對比RT-PCR和PCR-RFLP技術(shù)，證明3’-mismatch PCR檢測克拉霉素耐藥性時(shí)具有更高的特異性[14]。

2.5肽核酸-熒光原位雜交(PNA-FISH)：原理是用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記DNA探針，然后將探針直接與完整細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)序列原位雜交，再用與熒光素分子耦聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合，最后利用熒光顯微鏡便可檢測到與熒光探針互補(bǔ)的核酸序列。FISH較PCR相比，不需要大量待測核酸，檢測方法更為準(zhǔn)確、迅速。PNA-FISH技術(shù)中應(yīng)用的是PNA探針，相比傳統(tǒng)的DNA探針，它能更好地與目標(biāo)基因雜交，適宜長度(15 bp)較短，且沒有靜電排斥[15]。目前，已有眾多研究利用該技術(shù)檢測到Hp對克拉霉素耐藥性，且獲得高敏感度及特異度[16，17]。該方法雖然快速、準(zhǔn)確，但不能檢測除克拉霉素以外其他抗生素的耐藥性，且具有侵入性，不適合兒童和老人。

2.6基因芯片也被稱為DNA微陣列，原理是將許多特定的DNA片段有規(guī)律地固定在支持物上，再與熒光探針標(biāo)記的待測序列雜交，然后通過熒光檢測系統(tǒng)對芯片掃描后進(jìn)行檢測分析，從而獲得定性、定量的結(jié)果。在Xuan等的報(bào)告中指出以酶比色法為基礎(chǔ)的基因芯片技術(shù)檢測的耐藥性結(jié)果與DNA測序結(jié)果有96.83%一致性，且有很高的靈敏度和可重復(fù)性[18]。該技術(shù)能同時(shí)檢測多種抗生素、多種基因、多位點(diǎn)突變，但高昂的費(fèi)用使其在臨床應(yīng)用中略顯不足。目前在姚雪的文章中建立了一種可同時(shí)檢測Hp克拉霉素、喹諾酮耐藥位點(diǎn)的可視化基因芯片檢測方法，其準(zhǔn)確性與測序技術(shù)相當(dāng)，不僅快速、敏感，而且大大降低了成本[19]，為我們接下來的研究設(shè)計(jì)提供了借鑒和指導(dǎo)。

2.7DNA測序作為分子生物學(xué)檢測方法中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，目前該技術(shù)：(1)用來驗(yàn)證其他檢測方法的可靠性；(2)發(fā)現(xiàn)新的其他未知突變。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，DNA測序技術(shù)變得更為直接、準(zhǔn)確，可進(jìn)行多耐藥突變檢測。Alfizah等收集了161例胃粘膜標(biāo)本，利用基因測序技術(shù)成功檢測到Hp對克拉霉素、喹諾酮類抗生素多耐藥基因突變[20]。該技術(shù)雖然準(zhǔn)確可靠，但是因測序儀器昂貴、模板濃度不當(dāng)、引物設(shè)計(jì)不合理等原因，目前多應(yīng)用于科研單位或?qū)I(yè)測序公司。

3 結(jié)論

馬斯特里赫特IV-佛羅倫薩共識(shí)報(bào)告指出，當(dāng)Hp對克拉霉素的耐藥率達(dá)到或超過15%-20%時(shí)，選擇克拉霉素治療Hp前應(yīng)先行耐藥性檢測[21]。目前，我國Hp對克拉霉素耐藥率高，掌握Hp耐藥狀況對選擇正確的治療方案具有重要意義，而不管是傳統(tǒng)藥敏-培養(yǎng)試驗(yàn)還是最新的分子生物學(xué)方法都尚未在臨床得到推廣。傳統(tǒng)方法因其費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等缺點(diǎn)已不考慮納入臨床診斷，分子生物學(xué)檢測方法因其專一、快速、敏感成為我們研究的重點(diǎn)。在Hp對克拉霉素耐藥性分子生物學(xué)檢測方法研究中，針對 23S rRNA基因突變，主要應(yīng)用PCR技術(shù)，其中最被看好的是RT-PCR方法，其解決了PCR易污染問題，可以檢測胃粘膜、糞便和唾液等標(biāo)本，不僅準(zhǔn)確、靈敏、高效、經(jīng)濟(jì)，而且真正實(shí)現(xiàn)了定性到定量的飛躍，目前已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于科研及臨床診斷中，相信不遠(yuǎn)的將來，該技術(shù)能得到廣泛推廣。