甜菜SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物不同檢測方法的比對研究

孫燕紅 ，馬龍彪 ，2，3，興旺 ，2，3，吳則東 ，2，3*

（1．黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實驗室，哈爾濱150080；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實驗室，哈爾濱150080）

甜菜作為我國一種重要的糖料作物，在我國的發(fā)展從無到有，又經(jīng)歷了上個世紀(jì)快速發(fā)展，1988年僅黑龍江省的甜菜種植面積就達(dá)到了約600萬畝（40萬hm2）[1]，進(jìn)入新世紀(jì)以來，由于國際市場的沖擊，許多糖廠紛紛倒閉，甜菜的種植面積也在不斷的萎縮。但從十三五開始，受到國家利好政策的影響，甜菜種植面積開始逐步提升，目前全國甜菜的種植面積在300萬畝（20萬hm2）左右。

目前已有多種分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到了甜菜的許多方面，如 RFLP[2]、RAPD[3]、AFLP[4]、SRAP[5-6]、SNP[7]以及SSR[8]等，這些分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜遺傳多樣性分析、品種鑒定、基因克隆以及抗病基因的定位等許多方面發(fā)揮著重要的作用。SRAP分子標(biāo)記由于具有引物量大，通用性好，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到了多種作物上，如棉花[9]、香蕉[10]、菊苣[11]、苦蕎[12]、甘薯[13]、木瓜[14]、梅[15]、玫瑰[16]等。 SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜上的研究，國內(nèi)研究的較多，如王華忠等[17]構(gòu)建了SRAP分子標(biāo)記的擴(kuò)增體系；王茂芊等[5，18-20]利用SRAP分子標(biāo)記對甜菜的抗根腐病品種、抗褐斑病品種以及不同區(qū)域的品種進(jìn)行遺傳多樣性分析；王華忠等[21]同時采用SRAP和SSR分子標(biāo)記技術(shù)對不同類型的甜菜進(jìn)行了遺傳多樣性分析。SRAP分子標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法一般分為兩種，一種是使用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[9，13]，一般使用的緩沖液是0．5倍的TBE；另外就是通過瓊脂糖凝膠電泳檢測[15-16]，使用的緩沖液是1倍的TAE。吳則東等人比較了變性聚丙烯酰胺凝膠和非變性聚丙烯酰胺凝膠的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)兩者之間差異不大，但非變性聚丙烯酰胺凝膠無論是制膠還是檢測都要比變性聚丙烯酰胺凝膠更加簡單，故推薦非變性聚丙烯酰胺凝膠替代變性聚丙烯酰胺凝膠[22]；目前SRAP分子標(biāo)記在甜菜上一般都是使用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測[6，18，20-21]，那么甜菜SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳檢測上到底有多大的區(qū)別，哪種檢測方法更加適合，本文將就此進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗中用到的 8 個甜菜品系：HW-10、HW-6、2N03208、H1492、JV14、TH46、NH6、JV34，均來自于黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院甜菜高品質(zhì)品種改良課題組，分別以編號1～8代替。實驗中用到的引物均來自于文獻(xiàn)[16]。

1.2 實驗方法

分別采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和2%的瓊脂糖凝膠電泳對SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后，利用1倍的Gelred核酸染料進(jìn)行泡膠10min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

在購物方面，旅行社會提供游客多種選擇，涵蓋旅游目的地豪華的購物中心以及富有菲律賓民俗風(fēng)情的特產(chǎn)店、集貿(mào)市場。就赴菲游客而言，在購物中心購物的風(fēng)險較小，能夠享受更舒適的購物環(huán)境以及獲得高質(zhì)量的商品；在集貿(mào)市場或景區(qū)外的特產(chǎn)店的感知風(fēng)險更高，其原因可能是該類購物場所人員復(fù)雜，容易發(fā)生盜竊事件，商品的質(zhì)量不能得到較好的保證等等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在同一遷移率位置，有帶記為1，無帶記為0，計算不同引物的多態(tài)性條帶以及總條帶數(shù)，分析不同引物在不同凝膠系統(tǒng)上電泳的差異。

2 結(jié)果與分析

試驗所得的多態(tài)性條帶和總條帶數(shù)見表1。實驗中用到的9對SRAP引物，有3對引物在6%的聚丙烯酰胺凝膠和2%的瓊脂糖凝膠中擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)以及總條帶數(shù)均相同，另外6對引物6%的聚丙烯酰胺凝膠中擴(kuò)增出的條帶無論是總條帶數(shù)還是多態(tài)性條帶數(shù)均高于2%的瓊脂糖凝膠，但差異不大。圖1為引物EM16-ME19在不同凝膠系統(tǒng)上的擴(kuò)增結(jié)果，從圖1可以看出，雖然兩種凝膠擴(kuò)增的多態(tài)性條帶和總條帶數(shù)均相同，但6%聚丙烯酰胺凝膠上的一些雜帶在2%的瓊脂糖凝膠上并沒有顯現(xiàn)出來，這對于條帶的分析非常有利。

3 結(jié)論

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)由于多態(tài)性比較好，引物數(shù)量較多，且適用于所有的物種，因此自開發(fā)以來就得到了廣泛的應(yīng)用。本文分別通過利用兩種不同的凝膠系統(tǒng)對甜菜SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)甜菜SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性較好。而且通過兩種凝膠系統(tǒng)的檢測后發(fā)現(xiàn)，2%的瓊脂糖凝膠在多態(tài)性條帶的檢測上一般和6%的聚丙烯酰胺凝膠相差不大，有的引物檢測的條帶數(shù)會略低于6%的聚丙烯酰胺凝膠，但2%的瓊脂糖對于擴(kuò)增較弱的一些產(chǎn)物基本上沒有顯示，因此讀帶相對比較容易，另外瓊脂糖凝膠相對于聚丙烯酰胺凝膠來說，制作比較簡單，凝膠本身又沒有聚丙烯酰胺凝膠原料（包括丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED以及過硫酸銨）的毒性，同時在顯影上，由于使用無毒的核酸染料，使得瓊脂糖凝膠電泳從制作到檢測均不涉及有毒物品，因此推薦甜菜SRAP標(biāo)記的檢測使用2%的瓊脂糖凝膠電泳。